8. 식품 중 잔류동물용의약품 시험법

8.1 일반원칙

가. 동물용의약품의 잔류허용기준(불검출 기준일 경우 정량한계 수준)을 확인할 수 있는 미생물수용체법, 형광면역측정법, 효소면역측정법 등의 원리를 이용한 검사키트 또는 방법으로서 시험할 수 있으나 시험결과 양성인 경우에는 규정한 정량시험법에 따라 시험하여 판정하여야 한다. 다만, 제조․가공직전의 원유 및 활어 등 원료 축·수산물에 대해 신속한 검사가 요구될 경우에는 상기의 검사키트 또는 방법으로 판정할 수 있다.

나. 시험법 적용범위에 가공식품 등 대상식품이 해당되지 않을 경우에도 해당 동물용의약품의 정량시험법에 준하여 시험할 수 있다.

다. 동시 다성분 시험법의 경우 단일 물질이나 일부 물질만 분석할 경우에도 해당 시험법을 적용할 수 있다.

라. 시료는 원료의 함량, 특히 건조 등의 과정으로 인하여 수분 함량이 변화된 경우 수분 함량을 고려하여 시험용액의 조제과정에서 시료량을 조정할 수 있다.

마. 검체의 처리

식품의 종류에 따라 아래 표에서와 같이 처리한 것을 시료로 하여 균질화한다. 다만, 이 표에서 정하지 아니한 식품은 원칙적으로 가식부를 시험부위로 한다.

식 품	시 료	최소요구량
식육류 소, 돼지, 말, 양 등	근육 부위	100 g
	지방(육안으로 확인되는 지방 10 g을 채취하거나 분석을 위한 지방 10 g을 수집할 수 있는 충분한 양의 부위)	10 g
	신장, 간	50 g
가금류 닭, 오리, 거위, 칠면조 등	피부와 뼈, 내장 제거한 근육 부위	100 g
	지방(복부지방 또는 지방 10 g을 수집할 수 있는 충분한 양의 부위)	10 g
	신장, 간	전체 또는 50 g
유류 유, 산양유 등	전체를 균질화한 것	500 g 또는 500 mL
알류 알, 오리알 메추리알 등	10개 또는 이와 동등한 양 20개 또는 이와 동등한 양	500 g 200 g
어류 미꾸라지, 빙어, 멸치	머리, 꼬리, 뼈, 내장, 껍질 포함한 전체	500 g
그 외 어류(넙치, 조피볼락(우럭) 등)	머리, 꼬리, 뼈, 내장, 비늘을 제거한 껍질 포함한 근육부위	500 g
갑각류 새우류(대하, 흰다리새우 등)	껍질, 머리, 꼬리, 다리 등을 제거한 근육부위	500 g
작은 민물새우류(6 cm이하)	껍질을 포함한 전체	500 g
기타 갑각류	껍질, 내장 등을 제거한 근육부위	500 g
패류 가리비, 새조개, 키조개	껍질과 내장을 제거한 근육부위와 관자	500 g
전복, 큰우렁(골뱅이), 고둥, 논우렁, (참)소라	껍질과 내장을 제거한 근육부위	500 g
기타패류(꼬막, 재첩, 굴 등)	껍질을 제거한 전체	500 g
벌꿀 액화소밀	벌집을 으깨어 0.5 mm×0.5 mm(또는 0.42 mm×0.42 mm) 크기의 정사각형 망체에 걸러 꿀을 벌집과 완전히 분리시킨 것	250 g
밀랍, 나뭇가지, 벌, 벌집 조각 등 이물질이 있는 경우	40℃ 수욕조에서 시료를 따뜻하게 하고, 면직포를 이용하여 걸러낸 것	250 g
시판 꿀	병 또는 통 전체를 균질화한 것	250 g

바. 표준용액 조제 및 정량

질량분석기를 사용하여 정량이 가능한 동물용의약품의 경우, 시료검량곡선(sample calibration curve) 작성을 위하여 각 해당 물질이 검출되지 않은 시료(바탕시료, blank sample)를 각각의 시험법에서 정한 시료량으로 준비한다. 바탕시료를 포함하여 5개 이상의 농도로 표준물질을 처리하여 시료표준용액을 제조한다. 각 농도별 시료표준용액에서 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한 후, 시험용액의 크로마토그램으로부터 시험용액 중 검출농도, 시료량, 최종 시험용액의 부피를 고려하여 정량한다.

다만, 바탕시료(blank sample)를 확보하기 어려운 경우에는 해당 시료에 표준물질을 농도별로 넣고 전처리 후 검량선을 작성하여 시료 중의 분석물질을 정량할 수 있다.

사. 질량분석기 분석을 위한 특성이온

1) 질량분석기를 이용하여 분석하는 경우, 개별 시험법에 명시하지 않더라도 각 선구이온(Precursor ion) 및 생성이온(Product ion)에 대한 질량분석기의 기기조건은 사용기기의 최적값으로 변경하여 사용할 수 있으며, 개별 시험법에서 제시된 이외의 이온도 적용이 가능하다.

2) 질량분석기를 사용하여 정성 및 확인시험을 하는 경우, 크로마토그램상의 피크는 시료표준용액 피크의 머무름 시간과 비교하여 일치하여야 한다. 또한 시료표준용액과 시험용액의 선구이온(precursor ion) 및 생성이온(product ion)이 일치하여야 하고, 표준용액과 시험용액의 생성이온간 반응세기의 비율(ion ratio)을 비교하여 생성이온간 반응세기의 비율은 허용범위에 적합하여야 한다(주1)).

주1) 생성이온간 반응세기의 비율 허용범위

이온간 반응세기의 비율(%)	허용범위
> 50%	± 20%
> 20% ≤ 50%	± 25%
> 10%, ≤ 20%	± 30%

8.2 정성시험법

8.2.1 생물학적 시험법

8.2.1.1 6-plate법

가. 시험법 적용범위
축․수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 테트라싸이클린계, 마크로라이드계, 페니실린계, 아미노글리코사이드계, 설폰아마이드계, 퀴놀론계, 세팔로스포린계, 펩타이드계, 폴리에테르계, 노보비오신(Novobiocin) 등의 항생물질 및 합성항균제의 잔류여부를 계통별로 확인한다.

다. 시약 및 시액

1) 배지

가) 계대, 증식용: nutrient agar

나) 증균용: tryptic soy broth(이하 TSB라 한다.)

다) 시험용: antibiotic medium No. 2(pH 6.55±0.05, 이하 AM #2라 한다.)

antibiotic medium No. 5(pH 7.9±0.1, 이하 AM #5라 한다.)

antibiotic medium No. 8(pH 5.85±0.05, 이하 AM #8라 한다.)

Mueller Hinton medium(pH 7.3±0.1, 이하 MH라 한다.)

test agar pH 6.0(pH 6.0, 이하 TA라 한다.)

EEC agar pH 8.0(물 1 L당 peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH2PO4 1.0 g 및 Agar 13.0 g, 이하 EEC라 한다.)

라) 아포 조제용: A-K #2 sporulating agar(BBL) 또는 nutrient agar(MnSO4∙H2O 0.005% 첨가)

2) 시험균액

가) B. megaterium(Bacillus megaterium ATCC 9885) 아포액(spore suspension, 포자현탁액)

보통배지에 계대배양(subculture)하여 보관한 시험균을 37℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병(roux bottle)에 접종하여 37℃에서 1일간 배양 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균수 25 mL를 넣어 집균한 후 65℃에서 30분간 가열한 후 3,000 ×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복하고 잔류물을 멸균수에 부유시켜 65℃에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 2×108 CFU/mL가 되도록 희석하여 사용한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관 한다.

나) B. subtilis(Bacillus subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633) 및 B. cereus(Bacillus cereus ATCC 11778)의 아포액(spore suspension, 포자현탁액)

Nutrient agar에 계대배양(subculture)하여 보관한 시험균을 멸균생리식염수 5 mL에 현탁시킨 후 nutrient agar 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 37℃에서 1일간 배양한 후 실온에서 6일간 아포를 형성시킨다. 멸균유리구슬과 멸균수 25 mL를 넣어 집균하여 65℃에서 30분간 가열한 후 3,000 ×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 반복하고 잔류물을 멸균수에 부유시켜 65℃에서 30분간 재가열한다. 이를 멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포농도를 9×106 CFU/mL 정도 되도록 멸균수로 희석 소분하고 냉장보관하여 사용한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관한다.

다) G. stearothermophilus(Geobacillus stearothermophilus ATCC 10149)의 아포액(spore suspension, 포자현탁액)

Nutrient agar에 계대, 보관되어온 균주를 멸균생리식염수 5 mL에 현탁시킨 후 nutrient agar 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 시험균을 55℃에서 1일간 배양한 후 멸균생리식염수 2～3 mL에 현탁시킨 후 아포조제용 배지 300 mL를 넣어 굳힌 배양병에 접종하여 55℃에서 1주일간 배양한다. 멸균유리구슬과 멸균수 25 mL를 넣어 집균한 후 85℃에서 15분간 가열한 후 3,000 ×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 제거한 다음 다시 멸균수에 부유시켜 세척을 3회 이상 반복하고 잔류물을 멸균수에 부유시켜 85℃에서 15분간 가열한 후 멸균수로 10단계 희석하여 표준한천배지로 균수를 측정한 후 아포액(spore suspension, 포자현탁액)의 농도를 7×106 CFU/mL 정도 되도록 희석 소분하여 냉장 보관한다. 장기간 보관 시에는 냉동보관한다.

라) E. coli(Escherichia coli ATCC 11303) 및 K. rhizophila(Kocuria rhizophila ATCC 9341)의 균액

시험일 하루 전 Triptic soy broth 20 mL에 계대 보존균을 직경 2 mm 백금이로 1 loopful을 접종하여 32℃(K. rhizophila), 37℃(E. coli)항온수조에서 16시간 흔들어 섞어 배양한다. 이 균액 1 mL를 멸균수 19 mL에 희석하여 사용하며(이때 균농도는 약 2×107 CFU/mL), 이 희석 균액은 4℃ 냉장보관하면서 약 1주일간 사용할 수 있다.

3) TMP(trimethoprim)용액: TMP 10 mg을 용량플라스크에 달아 메탄올 10 mL에 녹이고 멸균수를 넣어 100 mL로 한 후 15 mg/L 용액이 되도록 희석하여 B. megaterium 평판 조제 시 사용한다.

4) 페트리접시: 안지름 85±1 mm, 높이 20 mm의 밑면이 평평한 것

5) 디스크: 직경 10 mm, 펄프디스크(흡수량 0.07～0.08 mL)

6) 시험용 평판 검사용 감수성 디스크: 스트렙토마이신 감수성 디스크(직경 6 mm, 10 μg)

7) 착즙기

라. 시험용 평판 조제

1) B. megaterium 평판

멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 MH 배지 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL와 TMP용액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 페트리접시에 8 mL씩 분주하여 수평으로 유지하여 응고시킨다.

2) B. subtilis 평판

멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 AM #5 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다.

3) B. cereus 평판

멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 AM #8 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다.

4) G. stearothermophilus 평판

멸균 후 약 50℃ 온도에서 보존된 AM #2 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다.

5) E. coli 평판

멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 TA 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다.

6) K. rhizophila 평판

멸균 후 약 50℃로 가온 보존된 EEC 배지에 100 mL당 조제된 시험균액 1 mL를 넣고 충분히 섞은 후 B. megaterium 평판과 같이 조작한다.

마. 시험용 평판 검사

시험할 때마다 스트렙토마이신 감수성 디스크(10 μg)를 이용하여 각 시험용 평판의 감도를 확인한다. 즉, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, B. stearothermophilus, 및 K. rhizophila 평판에서는 스트렙토마이신 감수성 디스크의 저지환의 직경이 각 20 mm 이상 되는 평판을 사용하고 E. coli의 평판의 경우 직경이 약 15 mm 이상이 되는 것을 사용한다.

바. 시험조작

1) 짜내기법

시료를 가능한 한 무균적으로 잘게 잘라서 시료의 즙을 짜낸 뒤 그 즙을 디스크에 흡수시킨다. 흡수시킨 디스크를 검사용 평판 위에 놓는다. B. megaterium는 45℃, B. subtilis와 E. coli는 37℃, B. cereus와 K. rhizophila는 30℃, B. stearothermophilus는 55℃에서 16～18시간 배양한다.

2) 디스크 삽입법

유(乳)의 경우, 시료(다만, 분유류는 14% 수용액으로 조제)를 충분히 혼합하여 82℃로 2.5분간 가열 후 신속히 식혀 준비한다. 알(卵)의 경우, 난백과 난황을 흔들어 섞어 준비하고, 그 외 식품의 경우, 근육을 무균적으로 절개하여 준비한다. 준비한 시료는 디스크를 6개씩 삽입하여 30～60분간 체액을 흡수시킨다. 이후 디스크를 제거하여 6종류의 검사용 평판에 하나씩 올려놓고 가볍게 눌러준 다음 실온에 약 30분간 방치한 뒤 배양시킨다. 각 시험균은 짜내기법과 동일하게 배양한다.

사. 판정

저지환의 직경이 12 mm 이상인 것을 양성으로 판정한다. 양성으로 판정된 시료는 다음표에 따라 항생물질 또는 합성항균제의 계통을 추정할 수 있다.

B. megaterium (MH)	G. stearothermo-philus (AM #2)	B. subtilis (AM #5)	B. cereus (AM #8)	K. rhizophila (EEC)	E. coli (TA)	추정 물질 계통
++	++	+	++	+	+	Tetracycline계
++	+	++	+	++	－	Macrolide계
++	+++	－	－	++	+++	Penicillin계
+++	－	+	－	+	+++	Aminoglycoside계
++	－	－	－	－	－	Sulfonamide계
+	－	－	+	－	++	Quinolone계
+	+++	－	±	±	++	Cephalosporin계
+	+	－	－	－	－	Peptide계
－	++	－	+	－	－	Polyether계
+	++	－	++	+	－	Novobiocin

주) +++: 0.1 mg/kg 이하, ++: 0.1∼1 mg/kg, +: 1∼10 mg/kg, －

8.2.1.2 EEC 4-plate 법

가. 시험법 적용범위

식육에 적용한다.

나. 분석원리

Bacillus subtilis(Bs)와 Micrococcus luteus(Ml) 두 종류의 균주를 사용하고 배지의 pH조건을 6.0, 7.2, 8.0으로 하여 항균물질을 확인한다.

다. 시험재료

1) 시험균

가) Bacillus subtilis BGA

나) Micrococcus luteus ATCC9341

2) 배지

가) 계대용: nutrient agar(NA)

나) 증균용: tryptic soy broth(TSB)

다) 시험용: test agar(pH 6.0, pH 7.2, pH 8.0)

라) 아포조제용 AK #2 sporulating agar(BBL)

마) 균수 측정용: plate count agar(PCA) 또는 nutrient agar

3) 시험용 기구

가) 디스크: 평판검사용 감수성 디스크(직경 6 mm), 지육검사용 디스크(직경 10 mm)

나) 페트리접시: 87 × 15 mm 또는 이와 동등한 것

다) 기타: 균질기, 캘리퍼스 또는 눈금자, 원심분리관, 항온수조(50℃), 배양기(30℃), 멸균 피펫(10 mL), roux bottle, 외과용 메스 등

라. 시험균액 조제

1) B. subtilis BGA 아포액 조제

물 1 L에 해당하는 AK #2 sporulating agar(BBL) 또는 MnSO4·H2O 0.05 g을 보충한 nutrient agar에 agar 5 g을 보충하여 배양병(Roux bottle)에 250∼300 mL를 분주하여 121℃에서 15분간 멸균한 후 굳힌다. Nutrient agar 사면배지에 37℃에서 12시간 배양한 종균을 멸균수 2∼3 mL로 집균하여 roux bottle에 이식한다. 37℃, 18∼24시간 배양한 후 실온에 6일간 방치한 후 멸균 유리구슬(직경 4 mm)과 멸균수 25 mL를 넣고 조심스럽게 흔들어 집균하여 멸균 원심분리관에 옮긴 후 65℃에서 30분간 가열한다. 3,000 ×g로 10분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 침전물에 일정량의 물을 넣어 부유시켜 원심분리한다. 이와같이 침전물에 멸균수로 부유하여 원심분리하는 세척과정을 총 3회 반복한다. 마지막으로 원심분리하여 상층액을 버리고 남은 침전물에 멸균수 20 mL로 재부유시켜 70℃에서 30분간 가열한다. 이 아포원액을 plate count agar(PCA) 또는 nutrient agar를 이용해 아포액의 농도를 측정하여 멸균수로 107∼108 CFU/mL가 되도록 조정하고 4℃에서 냉장보관하면서 사용한다.

2) M. luteus ATCC 9341 균액

Tryptic soy broth(TSB) 20 mL에 계대 보존균을 백금이(직경 2 mm)로 1 loopful 접종한 후 32℃ 항온수조에서 16시간 동안 80 rpm으로 흔들어 섞어주며 배양한다. 이 균액 1 mL를 멸균수 19 mL에 희석하여 냉장보관하면서 1주일간 사용한다. 이때 균액농도는 2x107 CFU/mL이다.

※ 아포액의 농도 측정

멸균수를 사용하여 아포원액을 단계 희석하여 10-4∼10-7이 되는 희석용액을 만든다. 희석용액 1 mL를 희석농도별 3개씩 패트리디쉬에 분주한다. 여기에 멸균하여 약 50℃로 유지한 plate count agar 또는 nutrient agar 배지를 적당량 넣고 좌우로 잘 흔들어 희석균액과 배지를 고르게 혼합하여 굳힌다. 그 위에 같은 배지를 적당량 중층시켜 굳힌 후 30℃ 배양기에서 48시간 배양한다. 집락수가 30∼300개 되는 희석배수의 plate를 선택하여 평균집락수를 구하고 아포원액의 mL당 아포 농도를 환산한다. 예를 들어 10-6 희석 농도에서 평균 집락수가 50개일 경우, 아포 원액의 균수는 5×107 CFU/mL이다.

마. 시험용액 조제

1) Penicillin G(PG) 용액

100 mL의 용량플라스크에  PG․Na 또는 PG․K 60 mg을 취하여 멸균수로 표시선까지 채운 후 1,000배 희석하여 1 IU/mL(또는 0.6 mg/L)가 되도록 희석하여 사용한다(PG 1 unit=0.6 μg).

2) Sulfamethazine(SMZ) 용액

100 mL의 용량플라스크에 100 mg의 SMZ를 취하여 메탄올 10 mL로 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채워 1,000 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 50 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

3) Streptomycin(SM) 용액

100 mL 용량플라스크에 SM 100 mg을 취하여 표시선까지 멸균수로 채워 1,000 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 50 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

4) Trimethoprim(TMP) 용액

100 mL 용량플라스크에 10 mg의 TMP를 취하여 100 mL의 용량플라스크에 취해 메탄올 10 mL로 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채워 100 mg/L가 되도록 한다. 이 용액을 10 mg/L가 되도록 희석하여 사용한다.

바. 시험용 평판 조제

※ 평판배지 조제

Peptone 6.9 g, NaCl 5.1 g, KH2PO4 1.0 g, agar 13.0 g과 물 1 L를 넣고 가열하여 녹인다. 4개의 삼각플라스크에 동일한 양을 분주한 후 고압증기 멸균하여 50℃ 항온수조에서 2시간 동안 방치한다. 1 N NaOH 또는 1 N HCl을 사용하여 pH를 6.0, 7.2, 8.0으로 맞춘다(Bs: pH 6.0, 7.2, 8.0 / Ml: pH 8.0).

1) Bacillus subtilis(Bs) 평판

3종류의 Bs 배지(pH 6.0, 7.2, 8.0)에  2×106 CFU/mL농도로 희석한 Bs 아포액을 65℃에서 30분간 가열한 후 배지 100 mL당 1 mL씩을 넣고 혼합한다.(Bs pH 7.2 평판제조시에는 Bs 아포액을 넣을 때 TMP 10 mg/L 용액도 함께 배지 100 mL 당 1 mL 넣고 혼합한다.)피펫으로 6 mL씩 페트리디쉬(87 × 15 mm)에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 2∼3일 이내에 사용한다. 이때 제조한 Bs(pH 6.0, 7.2, 8.0)의 농도는 2×104 CFU/mL이다.

2) Micrococcus luteus(Ml) 평판

Ml 배지(pH 8.0)에 약 2×107 CFU로 희석한 Ml 균액을 배지 100 mL 당 1 mL를 넣고 혼합한다. 피펫으로 6 mL씩 페트리디쉬에 분주하여 뚜껑을 살짝 열어 둔 상태로 30분간 방치한 후 사용한다. 사용하고 남은 시험용 평판은 냉장보관하면서 1주일 이내에 사용한다. 이때 제조한 Ml(pH 8.0)의 농도는 2×105 CFU/mL이다.

사. 시험용 평판 및 시료 검사

1) 시험용 평판의 검사

직경 6 mm디스크에 Penicillin G, Sulfamethazine, Streptomycin 용액을 10 μg씩 흡습시킨 후 주1)의 표와 같이 해당되는 시험용 평판에 올려놓고, 32℃에서 16시간 배양하여 시험균의 저지환을 확인한다. 저지환의 크기가 주1)과 같이 디스크 직경 6 mm를 포함하여 12∼14 mm 이상이어야 한다.

주1) 시험용평판의 검사조건

시험용평판	항균물질	표준용액농도	디스크당 함량	최소주변억제대
Bs(pH 6.0) Bs(pH 7.2) Bs(pH 8.0) Ml(pH 8.0)	Penicillin G-Na Sulfamethazine Streptomycin Streptomycin	0.6 μg/mL 50 μg/mL 50 μg/mL 50 μg/mL	0.006 μg 0.5 μg 0.5 μg 0.5 μg	6 mm 이상 6 mm 이상 8 mm 이상 6 mm 이상

2) 시료 검사

가) 디스크법

식육의 근육을 절개한 후 핀셋으로 시료 당 지육 검사용 10 mm 디스크 4개씩을 삽입하여 30∼60분간 육즙을 흡수시킨다. 육즙을 흡수시킨 후 디스크를 꺼내어 4 종류의 검사용 평판에 하나씩 올려놓고 가볍게 눌러주고 실온에 약 30분간 방치한 후 32℃ 배양기에 넣어 16시간 배양하여 결과를 판정한다.

나) 직접법

식육을 사방 1 cm, 두께 2 mm 정도로 잘라 4 종류의 검사용 평판에 각각 올려놓고 실온에서 약 30분간 방치한 후 페트리디쉬를 뒤집지 않고 배양기에 넣어 32℃에서 16시간 배양하여 결과를 판정한다.

아. 시험결과 판정

1) 결과판정 방법

디스크법의 경우 디스크 직경 10 mm를 포함하여 저지환이 14 mm 이상인 평판이 하나 이상일 경우 해당시료를 양성으로 판정하며, 직접법의 경우 저지환의 폭이 1 mm 이상인 평판이 하나 이상일 때 양성으로 판정한다. 세균오염 등으로 인해 저지환이 불분명할 경우는 시험을 반복하고 재시험시 양성이 아닐 경우에는 음성으로 판정한다.

2) 양성시료의 항균물질 계열 추정

각 항균물질의 표준용액을 각 디스크 당 75 μL씩 흡수시킨 후 배양했을 때 주2)의 표와 같이 4종의 평판에서 저지환이 형성되는 양상을 비교하여 잔류 항균물질의 계열을 추정한다. 그러나 이 시험법은 잔류량이 매우 낮거나 높을 경우, 또는 여러 항균물질이 복합적으로 잔류할 경우는 추정이 불가능하므로 양성인 시료는 반드시 정량시험법에 따라 확인하여야 한다.

주2) EEC 4-plate 법의 표준 항균물질에 대한 최저검출한계(mg/L)

항 균 물 질	Bs 평판 pH 6.0	Bs 평판 pH 7.2	Bs 평판 pH 8.0	Ml 평판 pH 8.0
β-Lactams Penicillin G Ampicillin Amoxicillin Cloxacillin Nafcillin Cephalexin Cephazolin Aminoglycosides Streptomycin Dihydrostre ptomycin Gentamicin Neomycin Macrolides Erythromycin Spiramycin Tylosin Oleandomycin Lincomycin Tetracyclines Tetracycline Chlortetracycline Oxytetracycline Sulfonamides Sulfamethazine Sulfamerazine Sulfadimethoxine Sulfamonomethoxine Sulfaquinoxaline Sulfathiazole Polypeptides Bacitracin Polyethers Monensin Nitrofurans Furazolidone Quinolones Oxolinic acid Others Spectinomycin Chloramphenicol Trimethoprim	0.025 0.1 0.25 1 1 1 1 5 5 10 50 2.5 2.5 2.5 10 100 0.25 0.05 0.25 25 10 1 0.5 2.5 10 100 5 0.25 0.5 50 5 5	0.05 0.05 0.1 1 2.5 5 2.5 1 1 0.5 2.5 0.1 0.5 0.5 0.25 1 1 0.25 0.5 1 0.5 0.25 0.25 0.5 0.25 >100 5 0.1 1 25 2.5 2.5	0.05 0.05 0.25 2.5 2.5 10 2.5 0.5 0.5 0.5 1 0.05 0.5 0.5 0.5 25 5 2.5 2.5 100 100 50 100 50 50 >100 5 0.1 1 25 2.5 2.5	0.025 0.025 0.05 2.5 0.05 2.5 100 2.5 2.5 5 5 0.05 0.5 0.5 0.1 0.1 10 10 10 >100 >100 >100 100 >100 >100 10 10 >100 >100 50 2.5 25

8.2.1.3 TTC-II 법

가. 시험법 적용범위

유에 적용한다.

나. 분석원리

Streptococcus thermophilus 균주에 무색의 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)가 산화환원 반응 후 적색 triphenyl formazan 형성 유무를 통해 설파계, 페니실린계 항균제를 확인한다.

다. 시험재료

1) 시험균

Streptococcus thermophilus(ATCC 14485)

2) 배지

항균물질이 없는 10% 멸균탈지유배지를 공시균주 배양용 배지로 사용한다.

3) 시약

(1) Trimethoprim(TMP)

(2) p-Aminobenzoic acid(PABA)

(3) 2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride(TTC)

(4) Penicillinase(1,000 unit)

라. 시험용 배양균액 조제

ⓐ Streptococcus thermophilus 균주를 10% 멸지탈지유배지에 접종하여 37℃에서 12시간 배양한다. ⓑ 10% 멸균탈지유배지를 따로 준비한다. ⓐ와 ⓑ를 1:1로 혼합하여 시험용 배양균액으로 사용한다.

마. 시험 용액 조제

1) TTC 용액

멸균수와 TTC를 25:1(v/v)의 비율로 섞어 4% TTC 용액을 제조한 후 발색되지 않도록 7℃ 이하의 냉암소에서 보관한다.

2) TMP 용액

100 mL 용량플라스크에 TMP 50 mg을 취해 methanol 10 mL에 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채운다(500 mg/L). 멸균수로 10배 희석하여 50 mg/L가 되도록 제조한 후 시험용액으로 사용한다. 제조 후 냉장보관하고 2주 이내에 사용한다.

3) PABA 용액

100 mL 용량플라스크에 PABA 500 mg을 취해 멸균수 약 50 mL를 넣고 가온하여 녹인 후 멸균수로 표시선까지 채운다(5,000 mg/L). 멸균수로 10배 희석하여 500 mg/L가 되도록 제조한 후 시험용액으로 사용한다. 제조 후 실온보관하고 2주 이내에 사용한다.

4) Penicillinase 용액

Penicillinase(1,000 IU)를 멸균수 1 mL에 녹여 시험용액으로 사용한다.

바. 시료 검사

1) 스크리닝법

마개달린 멸균시험관 2개에 Zero control(TMP 무첨가 음성대조)과 TMP control(TMP 첨가 음성대조)로 표기하고 검사할 시료당 1개의 시험관에 시료번호를 기입한다. 검사할 시료의 멸균시험관에 시료 번호를 기입한 후 시료(유)를 각각 8 mL씩 취한다. 이때 대조용(주1))으로 사용할 Zero 및 TMP control시험관에는 항균물질이 들어있지 않는 유 각 8 mL를 취한다. Zero control에는 멸균수 1 mL를 넣고, TMP control과 검사할 시료의 시험관에는 TMP 용액(50 mg/L) 1 mL를 넣고 혼합한다. 80∼84℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 바로 수돗물에 담가 37℃ 이하로 급냉시킨다. 시험용 배양균액(1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 mL씩 접종하여 혼합하고 36.5∼37.5℃의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. TTC 용액 0.3 mL를 넣은 후 36.5∼37.5℃에서 30∼60분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다.

주1) 대조용 시료

대조용 원유시료는 사료첨가제 혹은 치료약제 등 을 투여하지 않은 원유를 채취하여 4℃ 냉장보관하면서 사용하고, 2∼3 일내 사용하지 못할 경우 -20℃ 혹은 -80℃에 보관하여 필요시 해동하여 사용한다. 탈지유를 검사할 경우 대조용 시료로는 항균물질이 들어 있지 않은 10% 멸균탈지유를 사용한다.

2) 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험

검사할 양성시료마다 마개달린 3개의 멸균시험관에 TMP tube, PABA tube 그리고 penase tube로 표기하고 시료번호도 기입한다. 3개의 시험관에 양성시료를 각 8 mL씩 취한 후 TMP tube(TMP용액 첨가용 시험관)와 penase tube(TMP 용액 및 penicillinase용액 첨가용 시험관)에는 TMP 용액(50 mg/L)을 각 1 mL씩 넣고, PABA tube(PABA용액 첨가용 시험관)에는 PABA 용액(500 mg/L) 1 mL를 넣고 혼합한다. 80∼84℃의 항온수조에서 2.5분간 가열한 후 바로 수돗물에 담가 37℃ 이하로 급냉시킨다. Penase tube에만 penicillinase 용액 100 μL를 넣고 혼합한다. 시험용 배양균액(1:1 희석균액)을 무균적으로 각 1 mL씩 접종하여 혼합하고 36.5∼37.5℃의 항온수조에서 2시간 동안 배양한다. 300 μL의 TTC 용액을 넣은 후 36.5∼37.5℃에서 30∼60분 동안 반응시킨다. TMP control 시료의 색상이 음성대조 시료의 색상과 거의 같은 시점을 반응 종료시간으로 한다.

사. 시험 결과 판정

1) 스크리닝법

TMP control의 색상을 기준으로 하여 시료의 색상이 TMP control 시료의 연분홍색보다 현저히 옅을 경우 양성으로 판정하고 같거나 진하면 음성으로 판정한다. 시료가 양성인 경우, 정량시험법에 따라 확인하여야 한다.

2) 설파제 및 페니실린계 항균물질 확인시험

TMP control의 색상을 기준으로 스크리닝법과 같이 판정하고, 주2) 표와 같이 결과를 추정할 수 있다.

주2) 판정기준

TMP tube	Penase tube	PABA tube	결과판정
음 성	음성	음성	음성
양 성	양성	음성	양성(설파제)
양 성	음성	양성	양성(페니실린계)
양 성	양성	양성	양성*

* 항균물질이 복합적으로 잔류될 경우 설파제나 페니실린계 항균물질도 동시에 검출될 수 있음

8.2.2 물리·화학적 시험법

8.2.2.1 축산물 중 동물용의약품 동시 다성분 시험법

8.2.2.1.1 축산물 중 항균제 등 동물용의약품 동시 다성분 시험법

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 아세토니트릴(알(卵)은 EDTA와 아세토니트릴)로 추출한 후 아세토니트릴 포화 헥산과 C18 분말로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 [표 1]의 용매를 참조하여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) C18 분말: 잔여 실란올기가 제거된 C18 분말(55-105 μm, 125 Å) 또는 이와 동등한 것

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

표 1. 표준원액 조제 용매

용매	대상 동물용의약품
메탄올	난드롤론, 날록손, 날리딕스산, 노르플록사신, 노보비오신, 다노플록사신, 답손, 데스후로일 세프티오퍼, 독시싸이클린, 디펜하이드라민, 디플록사신, 락토파민, 로페라미드, 록시스로마이신, 리팍시민, 린코마이신, 마보플록사신, 메토밀, 메토크로프라미드, 메트로니다졸-OH, DL-메틸에페드린, 모노아세틸 답손, 발네물린, 버지니아마이신, 베르베린, 사라플록사신, 설파구아니딘, 설파독신, 설파디메톡신, 설파디아진, 설파메라진, 설파메타진, 설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진, 설파모노메톡신, 설파퀴녹살린, 설파클로르피리다진, 설파클로진, 설파티아졸, 설파페나졸, 설피속사졸, 스코폴라민, 스피라마이신, 시프로플록사신, 시프로헵타딘, 아목시실린, 아미노피린, 아크리플라빈, 안티피린, 알트레노제스트, 암피실린, 에리스로마이신, 에마멕틴 B1a, 엔로플록사신, 오르메토프림, 오비플록사신, 오플록사신, 옥소린산, 옥시테트라싸이클린, 올라퀸독스(MQCA, 3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid), 올레안도마이신, 요힘빈, 조사마이신, 카바독스(QCA, quinoxaline-2-carboxylic acid), 카벤다짐, 클렌부테롤, 클로람페니콜, 클로르테트라싸이클린, 타일로신, 테트라싸이클린, 툴라스로마이신, 트리메토프림, 트리페레나민, 티아물린, 티암페니콜, 틸디피로신, 틸미코신, 페노뷰카브, 페노티아진, 페플록사신, 프라지콴텔, 플로르페니콜, 플로르페니콜아민, 플루메퀸
물	나프실린, 데스아세틸 세파피린, 디클록사실린, 벤질페니실린, 세파졸린, 세파피린, 세팔로니움, 세포페라존, 세프퀴놈, 옥사실린, 클록사실린
에틸아세테이트	로니다졸, 메트로니다졸
DMSO	세프티오퍼
아세토니트릴	디에틸카바마진, 아세트아닐라이드, 테트라메트린, 테트라미졸, 페나세틴
50% 메탄올	세팔렉신

※ 밑줄 표시되어 있는 것은 대사물질임

마. 시험용액 조제

1) 알(卵)을 제외한 식품

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 ⓐ 100% 아세토니트릴(소고기는 80% 아세토니트릴) 10 mL를 넣은 뒤, 10분간 흔들어 섞고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다. ⓑ 잔류물에 100% 아세토니트릴(소고기는 80% 아세토니트릴) 10 mL를 넣어 10분간 흔들어 섞고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다. C18 분말 1 g을 미리 넣어 둔 50 mL 원심분리관에 ⓐ와 ⓑ의 상층액을 합한다. 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣은 뒤 1분간 흔들어 섞고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액(헥산층)을 제거하고 하층(아세토니트릴층)을 새로운 원심분리관으로 옮긴다. 이를 50℃ 이하에서 질소 농축하여 건고한 후 메탄올 2 mL와 0.1% 포름산 수용액 2 mL로 녹이고 5분간 초음파 추출한다. 이 용액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 알(卵)

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 0.2 g EDTA(Etylenediamine tetraacetic acid)를 넣은 후 1분간 흔들어 섞어 혼합한다. ⓒ 100% 아세토니트릴 10 mL를 넣은 뒤, 10분간 흔들어 섞고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다. ⓓ 잔류물에 100% 아세토니트릴 10 mL를 넣은 뒤 10분간 흔들어 섞어 혼합하고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다. C18 분말 1 g을 미리 넣어 둔 50 mL 원심분리관에 ⓒ와 ⓓ의 상층액을 합한다. 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣은 후 1분간 흔들어 섞고 2,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액(헥산층)을 제거하고 하층액(아세토니트릴층)을 새로운 원심분리관으로 옮긴다. 이를 50℃ 이하에서 질소 농축하여 건고한 후 메탄올 2 mL와 0.1% 포름산 수용액 2 mL로 녹이고 5분간 초음파 추출한다. 이 용액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
1.0	90	10
6.0	60	40
10.0	5	95
15.0	5	95
15.1	90	10
20.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 3.4 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact Mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	나프실린 (Nafcillin)	9.4	Positive	414.4	414.1	437.2	261.11)	14
							278.1	16
							319.1	14
2	난드롤론 (Nandrolone)	9.4	Positive	274.4	274.2	275.0	81.0	26
							109.01)	26
							239.0	14
3	날록손 (Naloxone)	3.7	Positive	327.3	327.1	328.1	212.01)	36
							253.1	24
							268.3	24
4	날리딕스산 (Nalidixic acid)	8.5	Positive	232.2	232.1	233.0	104.0	38
							131.0	32
							159.01)	30
5	노르플록사신 (Norfloxacin)	4.7	Positive	319.3	319.1	320.1	204.8	32
							233.01)	22
							256.1	20
6	노보비오신 (Novobiocin)	10.5	Positive	612.6	612.2	613.3	133.0	62
							189.11)	28
							218.1	12
7	다노플록사신 (Danofloxacin)	5.0	Positive	357.3	357.1	358.0	95.9	27
							314.2	19
							340.11)	26
8	답손 (Dapsone)	6.1	Positive	248.3	248.1	248.7	92.0	24
							107.9	22
							155.91)	14
	모노아세틸 답손 (Monoacetyl dapson)	6.7	Positive	290.3	290.1	290.9	92.3	24
							108.0	20
							156.01)	12
9	독시싸이클린 (Doxycycline)	6.5	Positive	444.4	444.2	445.1	267.0	34
							321.11)	29
							428.2	16
10	디에틸카바마진 (Diethylcarbamazine)	3.1	Positive	199.2	199.2	200.1	72.0	20
							100.0	14
							127.01)	12
11	디클록사실린 (Dicloxacillin)	9.6	Positive	470.3	469.0	470.1	114.4	36
							160.01)	11
							310.8	14
12	디펜하이드라민 (Diphenhydramine)	7.8	Positive	255.3	255.2	256.1	115.0	50
							152.0	32
							167.11)	10
13	디플록사신 (Difloxacin)	5.8	Positive	399.3	399.1	400.0	279.0	38
							285.0	30
							299.11)	26
14	락토파민 (Ractopamine)	5.1	Positive	301.3	301.2	302.1	107.0	28
							121.01)	20
							284.1	14
15	로니다졸 (Ronidazole)	4.2	Positive	200.1	200.1	201.1	55.0	18
							110.0	14
							140.01)	8
16	로페라미드 (Loperamide)	9.1	Positive	477.0	476.2	477.0	115.0	33
							210.0	71
							266.01)	45
17	록시스로마이신 (Roxithromycin)	8.7	Positive	837.0	836.5	837.4	116.0	46
							158.11)	34
							679.4	20
18	리팍시민 (Rifaximin)	9.9	Positive	785.8	785.4	786.3	95.0	50
							151.0	34
							754.21)	20
19	린코마이신 (Lincomycin)	4.2	Positive	406.5	406.2	407.2	82.3	64
							126.0	28
							359.21)	18
20	마보플록사신 (Marbofloxacin)	4.6	Positive	362.3	362.1	363.2	72.0	19
							320.11)	15
							345.0	22
21	메토밀 (Methomyl)	5.0	Positive	162.2	162.0	163.0	65.0	4
							88.01)	6
							106.0	8
22	메토크로프라미드 (Metoclopramide)	5.4	Positive	299.8	299.1	300.1	140.9	44
							183.91)	26
							227.1	16
23	메트로니다졸 (Metronidazole)	3.4	Positive	171.1	171.1	172.0	82.01)	22
							98.2	16
							111.0	20
	메트로니다졸-OH (Metronidazole-OH)	5.7	Positive	187.1	187.1	188.2	68.0	22
							80.0	28
							123.11)	8
24	DL-메틸에페드린 (DL-methylephedrine)	4.2	Positive	179.2	179.1	180.1	57.0	16
							117.11)	18
							146.9	18
25	발네물린 (Valnemulin)	8.7	Positive	564.8	564.4	565.4	147.0	36
							164.0	28
							263.21)	16
26	버지니아마이신 (Virginiamycin M1)	9.0	Positive	525.5	525.2	526.2	109.0	32
							133.0	24
							355.01)	16
27	베르베린 (Berberine)	7.4	Positive	336.3	336.1	336.0	262.8	46
							278.01)	40
							303.7	28
28	벤질페니실린 (Benzylpenicillin)	8.3	Positive	334.3	334.1	335.0	91.0	38
							128.01)	22
							159.9	20
29	사라플록사신 (Sarafloxacin)	5.7	Positive	385.3	385.1	386.2	299.11)	24
							322.1	22
							348.1	32
30	설파구아니딘 (Sulfaguanidine)	2.2	Positive	214.2	214.1	215.1	60.0	10
							92.0	20
							156.01)	12
31	설파독신 (Sulfadoxine)	6.7	Positive	310.3	310.1	311.0	92.0	28
							108.1	24
							156.01)	16
32	설파디메톡신 (Sulfadimethoxine)	7.7	Positive	310.3	310.1	311.1	92.1	28
							108.11)	26
							156.1	18
33	설파디아진 (Sulfadiazine)	4.2	Positive	250.2	250.1	251.0	92.1	26
							108.1	22
							156.01)	14
34	설파메라진 (Sulfamerazine)	4.9	Positive	264.3	264.1	265.3	92.1	24
							108.0	22
							156.01)	16
35	설파메타진 (Sulfamethazine)	5.5	Positive	278.3	278.1	279.1	92.1	28
							124.1	22
							186.11)	16
36	설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole)	6.8	Positive	253.2	253.1	254.0	92.1	26
							108.0	20
							156.01)	14
37	설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxy pyridazine)	6.1	Positive	280.3	280.1	281.0	92.0	30
							108.0	24
							156.01)	14
38	설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine)	5.6	Positive	280.3	280.1	281.0	92.0	28
							108.0	24
							156.01)	16
39	설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline)	7.7	Positive	300.3	300.1	300.9	108.0	25
							155.91)	15
							207.7	18
40	설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine)	7.6	Positive	284.7	284.0	285.0	92.0	24
							108.0	22
							156.01)	14
41	설파클로진 (Sulfaclozine, Sulfachlorpyrazine)	6.4	Positive	284.7	284.0	285.0	92.0	26
							108.0	24
							155.91)	16
42	설파티아졸 (Sulfathiazole)	4.4	Positive	255.3	255.0	256.0	92.1	24
							108.1	22
							156.01)	14
43	설파페나졸 (Sulfaphenazole)	7.8	Positive	314.3	314.1	315.1	92.0	34
							158.21)	28
							158.8	22
44	설피속사졸 (Sulfisoxazole)	7.0	Positive	267.3	267.1	268.1	92.0	30
							113.0	16
							156.01)	14
45	세파졸린 (Cefazolin)	5.4	Positive	454.5	454.0	455.0	156.01)	12
							295.0	14
							323.0	8
46	세파피린 (Cephapirin)	3.4	Positive	423.4	423.1	424.1	152.0	22
							181.0	23
							292.01)	13
	데스아세틸 세파피린 (Desacetyl cephapirin)	2.2	Positive	381.4	381.1	382.1	111.8	22
							124.1	40
							152.01)	24
47	세팔렉신 (Cephalexin)	4.7	Positive	347.3	347.1	348.0	106.0	26
							158.01)	6
							174.0	14
48	세팔로니움 (Cefalonium)	4.7	Positive	458.5	458.1	459.1	152.0	16
							158.0	14
							337.01)	6
49	세포페라존 (Cefoperazone)	6.2	Positive	645.6	645.1	646.1	143.01)	28
							148.0	44
							530.1	8
50	세프퀴놈 (Cefquinome)	1.8	Positive	528.6	528.1	529.1	134.01)	12
							166.9	22
							396.0	10
51	세프티오퍼 (Ceftiofur)	7.1	Positive	523.5	523.1	524.1	95.0	42
							125.21)	58
							241.0	16
	데스후로일 세프티오퍼 (Desfuroylceftiofur)	5.4	Positive	429.5	429.1	430.1	125.9	32
							227.01)	22
							241.1	14
52	스코폴라민 (Scopolamine)	4.4	Positive	303.3	303.1	304.1	103.0	38
							138.11)	18
							156.1	14
53	스피라마이신 (Spiramycin)	6.0	Positive	843.0	842.5	843.4	101.0	42
							142.0	34
							174.11)	34
54	시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	4.9	Positive	331.3	331.1	332.0	203.1	36
							231.0	34
							245.01)	24
55	시프로헵타딘 (Cyproheptadine)	8.5	Positive	287.4	287.2	288.0	58.0	20
							70.0	22
							96.01)	22
56	아목시실린 (Amoxicillin)	2.6	Positive	365.4	365.1	366.1	113.91)	19
							134.0	31
							349.1	5
57	아미노피린 (Aminopyrine)	3.6	Positive	231.2	231.1	232.0	98.0	16
							113.01)	12
							113.0	14
58	아세트아닐라이드 (Acetanilide)	6.1	Positive	135.1	135.1	136.0	43.0	16
							51.0	74
							77.01)	22
59	아크리플라빈 (Acriflavine)	5.3	Positive	259.7	224.1	224.1	154.1	46
							164.9	40
							209.01)	26
60	안티피린 (Antipyrine)	5.6	Positive	188.2	188.1	189.0	55.6	22
							58.5	22
							104.11)	20
61	알트레노제스트 (Altrenogest)	10.3	Positive	310.4	310.2	311.0	159.0	24
							227.01)	22
							251.0	12
62	암피실린 (Ampicillin)	4.6	Positive	349.4	349.1	350.1	79.0	44
							106.01)	17
							114.0	30
63	에리스로마이신 (Erythromycin)	7.7	Positive	733.9	733.5	734.2	116.1	46
							158.11)	30
							576.3	18
64	에마멕틴 B1a (Emamectin B1a)	10.1	Positive	886.1	885.5	886.0	82.0	72
							126.0	44
							158.01)	34
65	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	5.2	Positive	359.4	359.2	360.1	203.2	36
							245.11)	24
							286.0	32
66	오르메토프림 (Ormetoprim)	5.1	Positive	274.3	274.1	274.9	80.9	43
							122.91)	25
							258.9	27
67	오비플록사신 (Orbifloxacin)	5.4	Positive	395.3	395.1	396.1	254.1	28
							295.0	22
							352.11)	16
68	오플록사신 (Ofloxacin)	4.8	Positive	361.3	361.1	362.0	205.0	38
							218.4	36
							261.11)	26
69	옥사실린 (Oxacillin)	8.9	Positive	401.4	401.1	402.2	114.1	36
							159.91)	13
							243.0	12
70	옥소린산 (Oxolinic acid)	8.6	Positive	261.2	261.1	262.0	160.1	35
							216.1	28
							244.11)	17
71	옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	4.9	Positive	460.4	460.1	461.1	201.0	40
							337.0	28
							426.11)	18
72	올라퀸독스 (Olaquindox: 3-methyl quinoxaline-2-carboxylic acid, MQCA)	5.7	Positive	263.2	188.1	189.2	102.1	27
							143.0	15
							145.01)	12
73	올레안도마이신 (Oleandomycin)	7.4	Positive	687.8	687.4	688.5	116.1	40
							158.11)	24
							544.3	14
74	요힘빈 (Yohimbine)	6.2	Positive	354.4	354.2	355.2	117.0	44
							144.01)	30
							212.1	20
75	조사마이신 (Josamycin)	8.9	Positive	828.0	827.5	828.3	83.0	46
							109.0	44
							174.11)	30
76	카바독스 (Carbadox: Quinoxaline-2-carboxylic acid, QCA)	5.3	Positive	262.2	174.0	175.1	102.1	29
							129.11)	16
							131.1	13
77	카벤다짐 (Carbendazim)	4.1	Positive	191.1	191.1	192.0	105.0	32
							132.0	30
							160.01)	14
78	클렌부테롤 (Clenbuterol)	5.9	Positive	277.1	276.1	277.1	140.1	44
							167.9	28
							203.11)	16
79	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	7.3	Negative	323.1	322.0	321.1	175.9	14
							194.0	10
							257.01)	10
80	클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline)	6.4	Positive	478.8	478.1	479.1	98.0	36
							154.01)	24
							444.0	18
81	클록사실린 (Cloxacillin)	9.2	Positive	435.8	435.3	436.1	114.1	38
							160.01)	11
							277.0	11
82	타일로신 A (Tylosin A)	7.9	Positive	916.1	915.5	916.4	88.0	74
							101.0	44
							174.11)	40
83	테트라메트린 (Tetramethrin)	12.0	Positive	331.4	331.4	332.0	107.0	40
							135.01)	14
							164.0	20
84	테트라미졸 (Tetramisole)	4.5	Positive	204.2	204.1	205.0	91.0	30
							123.0	24
							178.01)	20
85	테트라싸이클린 (Tetracycline)	5.3	Positive	444.4	444.2	445.1	98.0	34
							154.01)	22
							410.1	16
86	툴라스로마이신 (Tulathromycin)	5.0	Positive	806.0	805.6	806.5	116.1	38
							158.1	38
							577.31)	24
87	트리메토프림 (Trimethoprim)	4.7	Positive	290.3	290.1	291.2	123.0	24
							230.11)	22
							261.1	24
88	트리페레나민 (Tripelennamine)	6.3	Positive	255.3	255.4	256.1	72.0	28
							91.0	28
							119.21)	28
89	티아물린 (Tiamulin)	8.4	Positive	493.7	493.3	494.3	73.1	50
							119.0	40
							192.11)	20
90	티암페니콜 (Thiamphenicol)	5.3	Negative	356.2	355.0	354.1	185.0	22
							240.0	16
							290.01)	12
91	틸디피로신 (Tildipirosin)	4.0	Positive	734.0	733.5	734.5	88.0	60
							98.01)	34
							174.1	36
92	틸미코신 (Tilmicosin)	6.9	Positive	869.1	868.6	869.5	88.0	72
							174.01)	40
							696.4	40
93	페나세틴 (Phenacetin)	7.3	Positive	179.2	179.1	180.0	65.0	30
							92.8	22
							110.01)	18
94	페노뷰카브 (Fenobucarb)	10.3	Positive	207.2	207.1	208.0	77.0	51
							95.01)	17
							152.0	11
95	페노티아진 (Phenothiazine)	7.1	Positive	199.2	199.0	199.0	139.6	36
							166.91)	24
							139.0	36
96	페플록사신 (Pefloxacin)	4.8	Positive	333.3	333.1	334.1	70.0	34
							204.9	32
							233.01)	24
97	프라지콴텔 (Praziquantel)	9.5	Positive	312.4	312.2	313.1	83.1	22
							174.1	28
							203.11)	14
98	플로르페니콜 (Florfenicol)	6.8	Negative	358.2	357.0	356.1	151.9	16
							185.0	20
							335.91)	10
	플로르페니콜아민 (Florfenicol amine)	2.2	Positive	247.2	247.1	248.0	91.0	42
							130.0	25
							230.11)	10
99	플루메퀸 (Flumequine)	8.6	Positive	261.2	261.1	262.1	126.1	47
							202.1	31
							244.11)	17

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 검출한계

(단위: mg/kg)

구분		검출한계
계열	분석성분(Compound)	소	돼지	가금	알(卵)	유(乳)
구충제	카벤다짐	0.0009	0.001	0.0006	0.0009	0.0003
	테트라미졸	0.0006	0.0003	0.0006	0.0003	0.0006
	프라지콴텔	0.0003	0.0003	0.0003	0.0003	0.0006
니트로이미다졸계	로니다졸	0.002	0.002	0.002	0.0006	0.0006
	메트로니다졸	0.002	0.002	0.0009	0.003	0.0003
	메트로니다졸-OH	0.003	0.0003	0.0003	0.0006	0.001
디아미노피리미딘계	오르메토프림	0.009	0.006	0.02	0.006	0.0003
	트리메토프림	0.009	0.009	0.006	0.0003	0.003
린코사마이드계	린코마이신	0.009	0.03	0.02	0.002	0.02
마크로라이드계	록시스로마이신	0.001	0.0006	0.0006	0.0002	0.0006
	스피라마이신	0.003	0.006	0.003	0.002	0.02
	에리스로마이신	0.006	0.006	0.02	0.002	0.002
	올레안도마이신	0.02	0.0009	0.002	0.003	0.003
	조사마이신	0.003	0.003	0.003	0.002	0.002
	타일로신 A	0.03	0.02	0.02	0.06	0.006
	툴라스로마이신	0.02	0.006	0.006	0.003	0.003
	틸미코신	0.006	0.002	0.002	0.003	0.0006
살충제	메토밀	0.003	0.003	0.002	0.003	0.003
	에마멕틴B1a	0.0002	0.002	0.0002	0.0003	0.0009
	테트라메트린	0.001	0.0006	0.002	-	0.0006
	페노뷰카브	0.002	0.002	0.002	0.0006	0.002
설파제	설파구아니딘	0.01	0.02	0.01	0.006	0.003
	설파독신	0.003	0.01	0.02	0.006	0.02
	설파디메톡신	0.01	0.006	0.02	0.003	0.02
	설파디아진	0.01	0.006	0.006	0.003	0.009
	설파메라진	0.02	0.006	0.015	0.006	0.009
	설파메타진	0.003	0.006	0.003	0.003	0.006
	설파메톡사졸	0.006	0.003	0.009	0.006	0.03
	설파메톡시피리다진	0.006	0.009	0.01	0.006	0.003
	설파모노메톡신	0.006	0.006	0.002	0.002	0.01
	설파퀴녹살린	0.009	0.02	0.015	0.009	0.0006
	설파클로르피리다진	0.003	0.006	0.006	0.003	0.003
	설파클로진	0.006	0.003	0.003	0.003	0.003
	설파티아졸	0.003	0.006	0.002	0.002	0.003
	설파페나졸	0.001	0.006	0.003	0.001	0.0006
	설피속사졸	0.003	0.006	0.01	0.006	0.003
성장보조제	난드롤론	0.0003	0.0003	0.0006	0.0002	0.0003
	락토파민	0.002	0.002	0.009	0.006	0.006
	알트레노제스트	0.0003	0.00003	0.0003	0.0006	0.003
	클렌부테롤	0.00003	0.00006	0.00003	0.00003	0.00003
세팔로스포린계	세파졸린	0.009	0.006	0.003	0.0006	0.003
	세파피린	0.006	0.003	0.001	0.001	0.003
	데스아세틸 세파피린	0.009	0.006	0.003	0.003	0.0003
	세팔렉신	0.02	0.03	0.003	0.003	0.002
	세팔로니움	0.002	0.009	0.009	0.02	0.003
	세포페라존	0.02	0.003	0.009	0.02	0.003
	세프퀴놈	0.01	0.006	0.006	0.009	0.006
	세프티오퍼	0.09	0.12	0.003	0.001	0.006
	데스후로일세프티오퍼	0.06	0.2	0.003	0.009	0.02
소독제	아크리플라빈	0.0009	0.002	0.003	0.0009	0.0006
암페니콜계	클로람페니콜	0.00003	0.0001	0.0001	0.00009	0.0002
	티암페니콜	0.002	0.002	0.003	0.003	0.003
	플로르페니콜	0.03	0.02	0.009	0.002	0.003
	플로프페니콜아민	0.03	0.06	0.02	0.002	0.003
지사제	로페라미드	0.0009	0.002	0.003	0.0009	0.0006
	베르베린	0.0006	0.0009	0.0006	0.0003	0.0009
진정제	스코폴라민	0.0006	0.0009	0.0006	0.0003	0.0003
	페노티아진	0.003	-	0.003	0.0006	0.002
진해거담제	DL-메틸에페드린	0.001	0.0003	0.0009	0.0006	0.002
퀴녹살린계	올라퀸독스	0.0006	0.0003	0.0003	0.0003	0.0003
	카바독스	0.001	0.0009	0.0006	0.0003	0.006
퀴놀론계	날리딕스산	0.002	0.0006	0.001	0.002	0.001
	노르플록사신	0.00006	0.0001	0.00006	0.00006	0.0001
	다노플록사신	0.03	0.02	0.02	0.006	0.003
	디플록사신	0.1	0.09	0.06	0.0009	0.006
	마보플록사신	0.003	0.02	0.001	0.0009	0.009
	사라플록사신	0.002	0.002	0.0006	0.001	0.002
	시프로플록사신	0.03	0.02	0.01	0.00003	0.009
	엔로플록사신	0.02	0.003	0.006	0.0002	0.009
	오비플록사신	0.003	0.0003	0.002	0.002	0.003
	오플록사신	0.00003	0.00003	0.00003	0.0002	0.00003
	옥소린산	0.003	0.002	0.003	0.003	0.003
	페플록사신	0.00003	0.00003	0.00003	0.00009	0.00006
	플루메퀸	0.006	0.02	0.009	0.001	0.003
테트라싸이클린계	독시싸이클린	0.002	0.003	0.006	0.0006	0.0009
	옥시테트라싸이클린	0.03	0.03	0.03	0.006	0.009
	클로르테트라싸이클린	0.02	0.01	0.01	0.009	0.006
	테트라싸이클린	0.01	0.03	0.01	0.01	0.003
페니실린계	나프실린	0.003	0.003	0.003	0.006	0.006
	디클록사실린	0.009	0.02	0.02	0.002	0.003
	벤질페니실린	0.02	0.006	0.002	0.00006	0.0003
	아목시실린	0.009	0.003	0.002	0.001	0.0003
	암피실린	0.003	0.003	0.002	0.0003	0.0003
	옥사실린	0.0006	0.002	0.0006	0.0003	0.0003
	클록사실린	0.009	0.01	0.01	0.003	0.003
폴리펩타이드계	버지니아마이신	0.002	0.003	0.006	0.003	0.01
항균제 기타	노보비오신	0.0303	0.002	0.02	0.003	0.001
	답손	0.0003	0.0006	0.0006	0.0003	0.0009
	모노아세틸 답손	0.0003	0.0003	0.0006	0.0006	0.0006
	리팍시민	0.00009	0.002	0.002	0.002	0.01
	발네물린	0.002	0.001	0.001	0.001	0.003
	티아물린	0.0006	0.0009	0.002	0.003	0.002
	틸디피로신	0.03	0.003	0.003	0.0006	0.0009
항염증제	아미노피린	0.003	0.003	0.003	0.001	0.002
	아세트아닐라이드	0.0006	0.0009	0.001	0.0009	0.001
	안티피린	0.002	0.0003	0.0006	0.0003	0.0009
	페나세틴	0.0003	0.0003	0.0003	0.0003	0.0003
항히스타민제	디펜하이드라민	0.0009	0.0006	0.002	0.0009	0.0003
	시프로헵타딘	0.0006	0.0003	0.0003	0.0006	0.0003
	트리페레나민	0.0006	0.00009	0.0003	0.0001	0.0003
호흡촉진제	날록손	0.0009	0.0006	0.0006	0.0006	0.0006
기타 동물용 의약품	디에틸카바마진	0.0009	0.0006	0.001	0.0006	0.0006
	메토크로프라미드	0.002	0.002	0.006	0.001	0.0006
	요힘빈	0.002	0.0006	0.0003	0.0003	0.0003

5) 정량한계

구분		정량한계
계열	분석성분(Compound)	소	돼지	가금	알(卵)	유(乳)
구충제	카벤다짐	0.003	-	0.002	0.003	0.001
	테트라미졸	-	-	0.002	0.001	0.002
	프라지콴텔	0.001	0.001	0.001	0.001	0.002
니트로이미다졸계	로니다졸	-	-	-	-	-
	메트로니다졸	-	-	-	-	-
	메트로니다졸-OH	-	-	-	-	-
디아미노피리미딘계	오르메토프림	-	-	-	-	0.001
	트리메토프림	0.03	0.03	0.02	0.001	0.01
린코사마이드계	린코마이신	0.03	-	0.06	0.005	-
마크로라이드계	록시스로마이신	0.003	0.002	0.002	0.0006	0.002
	스피라마이신	-	-	-	-	0.05
	에리스로마이신	-	0.02	0.05	0.004	-
	올레안도마이신	-	0.003	0.006	0.009	0.009
	조사마이신	-	-	-	-	0.006
	타일로신 A	-	-	-	-	-
	툴라스로마이신	-	-	-	-	0.01
	틸미코신	0.02	0.005	0.006	0.01	0.002
살충제	메토밀	-	-	-	-	0.01
	에마멕틴B1a	-	-	0.0005	0.001	-
	테트라메트린	-	-	-	-	-
	페노뷰카브	-	-	-	-	-
설파제	설파구아니딘	-	-	-	-	-
	설파독신	-	0.04	0.05	0.02	-
	설파디메톡신	-	0.02	0.06	0.01	-
	설파디아진	-	-	-	-	-
	설파메라진	-	0.02	0.05	0.02	-
	설파메타진	0.01	0.02	0.01	0.01	0.02
	설파메톡사졸	-	0.01	0.03	0.02	-
	설파메톡시피리다진	0.02	-	0.04	0.02	-
	설파모노메톡신	0.02	-	-	0.006	-
	설파퀴녹살린	-	-	0.05	0.03	-
	설파클로르피리다진	-	-	0.02	-	-
	설파클로진	-	-	-	-	-
	설파티아졸	-	-	-	-	-
	설파페나졸	-	0.02	0.01	0.003	-
	설피속사졸	-	0.02	-	0.02	-
성장보조제	난드롤론	0.001	0.001	0.002	0.0005	0.001
	락토파민	-	0.007	-	-	-
	알트레노제스트	0.001	0.0001	0.001	0.002	-
	클렌부테롤	-	0.0002	0.0001	0.0001	0.0001
세팔로스포린계	세파졸린	-	0.02	0.01	0.002	0.01
	세파피린	-	-	-	-	-
	데스아세틸 세파피린	-	-	-	-	-
	세팔렉신	-	-	-	-	-
	세팔로니움	0.006	0.03	-	-	0.008
	세포페라존	-	0.01	-	-	0.02
	세프퀴놈	-	0.02	-	-	-
	세프티오퍼	-	-	0.01	0.004	-
	데스후로일세프티오퍼	-	-	-	-	-
소독제	아크리플라빈	0.003	-	-	0.003	0.002
암페니콜계	클로람페니콜	-	-	-	-	0.0005
	티암페니콜	-	-	-	-	-
	플로르페니콜	-	-	-	-	-
	플로프페니콜아민	-	-	-	-	-
지사제	로페라미드	0.002	0.006	0.002	0.002	0.003
	베르베린	0.002	-	-	-	-
진정제	스코폴라민	0.002	-	0.002	0.001	0.001
	페노티아진	-	-	-	-	-
진해거담제	DL-메틸에페드린	0.004	-	-	-	-
퀴녹살린계	올라퀸독스	0.002	0.001	0.001	0.001	0.001
	카바독스	0.004	-	-	-	-
퀴놀론계	날리딕스산	0.006	0.002	0.004	0.006	-
	노르플록사신	0.0002	0.0004	-	-	0.0004
	다노플록사신	-	-	0.05	-	0.01
	디플록사신	0.3	-	0.2	0.003	-
	마보플록사신	0.009	-	-	-	0.03
	사라플록사신	0.006	0.006	0.002	0.004	0.007
	시프로플록사신	-	-	-	-	-
	엔로플록사신	-	0.008	0.02	0.0005	-
	오비플록사신	0.01	0.001	0.007	0.005	-
	오플록사신	0.0001	0.0001	0.0001	-	0.0001
	옥소린산	0.01	-	-	0.01	0.01
	페플록사신	0.0001	0.0001	0.0001	0.0003	-
	플루메퀸	0.02	-	-	0.004	0.01
테트라싸이클린계	독시싸이클린	-	0.009	-	-	-
	옥시테트라싸이클린	-	-	-	-	-
	클로르테트라싸이클린	-	-	-	-	-
	테트라싸이클린	-	-	-	-	-
페니실린계	나프실린	-	-	-	-	-
	디클록사실린	-	-	-	-	-
	벤질페니실린	-	-	-	-	0.001
	아목시실린	-	-	-	-	-
	암피실린	-	-	-	-	0.001
	옥사실린	-	-	-	0.001	-
	클록사실린	-	-	-	-	-
폴리펩타이드계	버지니아마이신	-	-	-	-	0.04
항균제 기타	노보비오신	-	-	-	-	-
	답손	-	-	-	-	-
	모노아세틸 답손	-	-	-	-	0.002
	리팍시민	-	0.005	-	-	-
	발네물린	-	-	0.004	0.004	0.01
	티아물린	0.002	0.003	-	-	0.008
	틸디피로신	0.08	-	-	-	-
항염증제	아미노피린	-	-	-	-	-
	아세트아닐라이드	0.002	-	-	-	-
	안티피린	0.005	0.001	0.002	0.001	0.003
	페나세틴	-	0.001	0.001	0.001	0.001
항히스타민제	디펜하이드라민	0.003	0.002	0.005	0.003	0.001
	시프로헵타딘	-	-	-	-	-
	트리페레나민	0.002	-	-	-	0.001
호흡촉진제	날록손	0.003	-	0.002	0.002	-
기타 동물용의약품	디에틸카바마진	-	-	-	-	0.002
	메토클로프라미드	0.005	0.007	-	0.004	0.002
	요힘빈	-	0.002	0.001	-	0.001

(단위: mg/kg)

※ 정성만 가능한 물질은 ‘-’로 표시

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

1) 정성 및 확인시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 바. 5)항에서 정량한계가 제시된 물질에 한함)에 따르거나 식품공전 8.3의 정량시험법에 따라 정량한다. 단, 부적합 판정은 8.3의 정량시험법에 의한 결과가 우선한다.

2) 바. 5)항의 정량이 가능한 동물용의약품(정량한계 표시)의 경우, 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.2.2.1.2 축산물 중 구충제 동시 다성분 시험법

가. 시험법 적용범위

축산물에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 황산마그네슘(MgSO4) 및 PSA(Primary Secondary Amine)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올 또는 DMSO(Dimethyl sulfoxide)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 DMSO로 희석하여 사용한다.

5) 내부표준원액: 셀라멕틴(Selamectin) 표준품을 DMSO에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

6) 내부표준용액: 내부표준원액을 DMSO로 희석하여 사용한다.

7) 맥바인(Mcllvaine) 완충용액(pH 2): 0.1 M 구연산(citric acid, anhydrous) 500 mL에 0.2 M 인산나트륨(disodium hrdrogen phosphate) 45 mL 넣어 pH를 2로 맞춘다.

8) 20 mM 포름산(formic acid) 수용액: 100 mL 용량플라스크에 포름산 0.125 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

9) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

10) 0.2% 포름산(formic acid) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

11) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 조직(간, 신장), 유(乳)

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 내부표준용액 20 μL를 넣는다. 15초간 혼합한 후 염화나트륨 1 g을 넣은 후 흔들어 섞어 추출하고 물 2 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한다. 1% 초산 함유 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞어 추출한 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 MgSO4 900 mg, PSA 150 mg을 포함한 15 mL 원심분리관에 옮긴 후 30초간 강하게 흔들어 섞어 추출하고, 4,500 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 유리튜브에 옮긴다. 50℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축한 후 DMSO 500 μL로 녹이고 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 조직(근육), 알(卵)

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 내부표준용액 20 μL를 넣는다. 15초간 혼합한 후 염화나트륨 1 g을 넣어 흔들어 섞어 추출하고 맥바인 완충용액 2 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴:메탄올(9:1, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞어 추출한 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 MgSO4 900 mg, PSA 150 mg을 포함한 15 mL 원심분리관에 옮긴 후 30초간 강하게 흔들어 섞어 추출하고, 4,500 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 유리튜브에 옮긴다. 50℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축한 후 DMSO 500 μL로 녹이고 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 및 20 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.2%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
0.1	90	10
2.0	5	95
9.0	5	95
10.0	90	10
15.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision Energy, eV)
1	니클로사미드 (Niclosamide)	5.94	Negative	327.1	326.0	325	2891)	15
							171	26
2	니트록시닐 (Nitroxinil)	4.27	Negative	290.0	289.9	289	1271)	25
							162	10
3	도라멕틴 (Doramectin)	7.62	Positive	899.1	898.5	922	7781)	45
							449	45
4	라폭사니드 (Rafoxanide)	8.60	Negative	626.0	624.8	624	1271)	35
							345	35
5	레바미졸 (Levamisole)	1.70	Positive	204.2	204.1	205	1781)	20
							123	30
6	모란텔 (Morantel)	3.92	Positive	220.3	220.1	221	1641)	25
							111	25
7	목시덱틴 (Moxidectin)	7.68	Positive	639.8	639.4	662	4671)	40
							549	40
8	비치오놀 (Bithionol)	6.13	Negative	356.0	355.9	355	1631)	20
							194	25
9	아바멕틴 (Abamectin)	6.97	Positive	873.1	872.5	895.4	7511)	45
							449	45
10	에마멕틴 (Emamectin)	5.53	Positive	886.1	885.5	886.4	1581)	35
							82	35
11	에프리노멕틴 (Eprinomectin)	6.65	Positive	914.1	913.5	937	4901)	55
							368	55
12	이버멕틴 (Ivermectin)	8.30	Positive	875.1	874.5	898	7531)	45
							609	45
13	옥시클로자니드 (Oxyclozanide)	5.31	Negative	401.4	400.9	400	2021)	20
							364	15
14	클로르설론 (Clorsulon)	3.94	Negative	380.7	378.9	378 380	3421)	3
							344	6
15	클로르플루아주론 (Chlorfluazuron)	6.24	Negative	540.6	539.0	540	3571)	20
							177	40
16	클로산텔 (Closantel)	6.90	Negative	663.1	661.9	661	1271)	50
							345	35
17	피란텔 (Pyrantel)	3.68	Positive	206.3	206.1	207	1501)	30
							109	45
18	프라지콴텔 (Praziquantel)	4.90	Positive	312.4	312.2	313	2031)	15
							174	35
19	플루아주론 (Fluazuron)	5.86	Positive	506.2	505.0	506	1581)	20
							349	20
20	셀라멕틴* (내부표준물질) (Selamectin, IS)	8.35	Positive	770.0	769.4	770	3331)	15
							608	15

1) 정량이온

* 셀라멕틴(Selamectin)은 아버멕틴계 구충제의 내부표준물질임

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

1) 정성시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 식품공전 8.3의 정량시험법을 따른다.

2) 8.3 정량시험법에 해당물질의 시험법이 없을 경우, 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.2.2.1.3 축산물 중 비스테로이드성 항염증제(NSAIDs) 동시 다성분 시험법

가. 시험법 적용범위

축산물에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 포름산암모늄 함유 아세토니트릴:물(4:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 C18을 이용한 분산고체상추출법으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

5) 200 mM 포름산암모늄 수용액: 100 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 1.25 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) C18 충전제: 입자크기 37∼55 μm, 공극크기 125 Å 또는 이와 동등한 것

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 200 mM 포름산암모늄 수용액 0.1 mL와 물 2 mL를 넣어 흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴 8 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞어 혼합한 후 10,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 C18 분말 500 mg을 분산시킨 후, 헥산 10 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞는다. 10,000 ×g에서 5분간 원심분리하고, 눈금이 표시된 시험관에 하층액 5 mL를 취해 옮긴 후, 40℃ 이하에서 1 mL가 되도록 질소 농축한다. 농축액 1 mL 중 0.5 mL를 취하여 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.00	90	10
0.20	90	10
2.50	5	95
3.50	5	95
3.51	90	10

다) 이동상 유량: 0.5 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	디클로페낙 (Diclofenac)	2.20	Negative	296.1	295.0	294.1	250.11)	10
							214.2	20
2	멜록시캄 (Meloxicam)	2.02	Negative	351.4	351.0	350.0	146.11)	20
							286.1	15
3	아세틸 살리실산 (Acetyl salicylic acid)	1.53	Negative	180.1	180.0	137.0	93.11)	15
							65.2	30
4	카프로펜 (Carprofen)	2.15	Negative	273.7	273.1	272.0	228.01)	15
							226.0	30
5	케토프로펜 (Ketoprofen)	2.00	Positive	254.2	254.1	255.0	209.11)	15
							105.1	25
6	톨페남산 (Tolfenamic acid)	2.36	Negative	261.7	261.1	260.0	216.11)	15
							35.1	25
7	파라세타몰 (Paracetamol)	0.56	Positive	151.1	151.1	152.0	110.11)	20
							65.1	30
8	페닐부타존 (Phenylbutazone)	2.27	Negative	308.4	308.2	307.1	131.11)	25
							279.2	20
9	플루닉신 (Flunixin)	2.05	Negative	296.2	296.1	295.0	251.11)	15
							209.1	30

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

Paracetamol 152.00>110.05 (+)

Acetylsalicylic acid 137.00>93.10 (-)

Ketoprofen 255.00>209.05 (+)

Oxyphenyl butazone 322.20>295.10 (-)

Meloxicam 350.00>146.10 (-)

Flunixin 295.00>251.10 (-)

Carprofen 272.00>228.00 (-)

Diclofenac 294.10>250.05 (-)

Phenylbutazone 307.10>131.05 (-)

Tolfenamic acid 260.00>216.10 (-)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

1) 정성시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 식품공전 8.3의 정량시험법을 따른다.

2) 8.3 정량시험법에 해당물질의 시험법이 없을 경우, 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.2.2.2 수산물 중 동물용의약품 동시 다성분 시험법

가. 시험법 적용범위

수산물(어류, 갑각류) 등에 적용한다.

나. 분석원리

균질화한 시료에 0.1 M EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액(pH 4.0)으로 산처리 후, 80% 아세토니트릴로 추출하고 C18, PSA(Primary Secondary Amine)를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 [표 1]의 용매를 참조하여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

5) 0.1 M Na2-EDTA가 함유된 50 mM 아세트산암모늄 완충용액: 1 L 용량플라스크에 아세트산암모늄 3.85 g을 넣고 물 0.9 L로 녹인 후 초산으로 pH를 4.0으로 맞춘다. 여기에 EDTA-나트륨(Na2-EDTA dihydrate) 37.1 g을 넣고 녹인 후 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1 L 용량 플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 2 mM 포름산암모늄 수용액: 1 L 용량 플라스크에 포름산암모늄 0.126 g을 넣고 아세토니트릴:물(80:20, v/v) 혼합용액으로 녹여 표시선까지 채운다.

8) 2 mM 포름산 암모늄 및 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴: 1 L 용량 플라스크에 물 1 mL와 포름산 암모늄 0.126 g을 잘 녹인 다음 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

10) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

표1. 표준원액 조제에 사용되는 용매

용매	대상 동물용의약품
메탄올	날리딕스산, 노르플록사신, 다노플록사신, 독시싸이클린, 디아베리딘, 디플록사신, 린코마이신, 마보플록사신, 메벤다졸, 메벤다졸 아민, 5-하이드록시 메벤다졸, 미노싸이클린, 비치오놀, 설파구아니딘, 설파독신, 설파디메톡신, 설파디아진, 설파메라진, 설파메타진, 설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진, 설파모노메톡신, 설파퀴녹살린, 설파클로르피라진, 설파클로르피리다진, 설파티아졸, 설파페나졸, 설피속사졸, 세파드록실, 세팔렉신*, 세프티오퍼*, 데스후로일세프티오퍼*, 스피라마이신*, 시프로플록사신, 에리스로마이신, 에토파베이트, m-페네티딘, 엔로플록사신, 오르메토프림, 오플록사신, 옥소린산, 옥시테트라싸이클린, 올레안도마이신, 조사마이신, 클로르테트라싸이클린, 클록사실린 클린다마이신, 키타사마이신, 테트라싸이클린, 트리메토프림, 트리클로르폰*, 티아물린, 티아벤다졸, 5-하이드록시 티아벤다졸, 티암페니콜, 틸미코신*, 페노뷰카브, 페플록사신, 푸마길린, 프라지콴텔, 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 플루메퀸
50% 메탄올	데하이드로콜산, 벤질페니실린, 아목시실린, 암피실린, 클로람페니콜

※ 밑줄 표시 되어 있는 것은 대사물질임.

※ 대상 동물용의약품은 1,000 mg/kg 농도의 표준원액 혼합물로 제조하여 1개월간 안정함(단, * 표시 물질은 쉽게 분해되므로 실험직전에 만들어서 사용)

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1 M Na2-EDTA in 50 mM 아세트산암모늄 완충용액 1 mL를 넣어 산처리 후, 2 mM 포름산암모늄 9 mL를 넣어 5분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 10,000 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 PSA 250 mg, C18 250 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 취하여 1분간 흔들어 섞고, 4℃에서 10,000 ×g로 5분간 원심분리한다. 상층액 중 5 mL를 취하여 잔류물이 1 mL가 되도록 40°C 이하에서 질소 농축한다. 농축 후 1 mL를 취하여 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 2 mM 포름산암모늄(ammonium acetate) 및 0.1% 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
1.0	90	10
6.0	60	40
10.0	5	95
15.0	5	95
15.1	90	10
20.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 3.8 kV(Positive), 2.6 kV(Negative)

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화(Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	날리딕스산 (Nalidixic acid)	6.77	Positive	232.2	232.08	233	104 187 2151)	36 25 12
2	노르플록사신 (Norfloxacin)	3.27	Positive	319.3	319.13	320	233 2761) 302	20 15 20
3	다노플록사신 (Danofloxacin)	3.56	Positive	357.4	357.14	358	231 3141) 340	30 15 20
4	데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)	7.41	Negative	402.5	401.10	401	2151) 249 331	30 32 23
5	독시싸이클린 (Doxycycline)	5.01	Positive	444.4	444.15	445	267 321 4281)	34 29 16
6	디아베리딘 (Diaveridine)	2.83	Positive	260.2	260.13	261	81 1231) 245	40 25 28
7	디플록사신 (Difloxacin)	4.21	Positive	399.4	399.13	400	2991) 356 382	25 20 20
8	린코마이신 (Lincomycin)	2.76	Positive	406.5	406.21	407	1261) 172 359	30 20 18
9	마보플록사신 (Marbofloxacin)	3.11	Positive	362.4	362.13	363	721) 320 345	20 15 20
10	메벤다졸 (Mebendazole)	6.46	Positive	295.2	295.09	296	104 165 2641)	30 40 20
10-1	메벤다졸 아민 (Mebendazole amine)	4.51	Positive	237.2	237.09	238	1051) 133 160	25 30 25
10-2	5-하이드록시 메벤다졸 (5-hydroxy mebendazole)	4.50	Positive	297.3	297.11	298	79 160 2661)	35 35 20
11	미노싸이클린 (Minocycline)	3.02	Positive	457.5	457.18	458	283 3521) 441	43 28 15
12	벤질페니실린 (Benzylpenicillin, Penicillin G)	6.58	Positive	334.4	334.09	335	114 1601) 176	30 15 15
13	비치오놀 (Bithionol)	10.4	Negative	356.0	354.90	355	1611) 163 194	28 28 25
14	설파구아니딘 (Sulfaguanidine)	1.13	Positive	214.2	214.05	215	60 92 1561)	12 10 5
15	설파독신 (Sulfadoxine)	5.00	Positive	310.3	310.07	311	92 108 1561)	28 24 16
16	설파디메톡신 (Sulfadimethoxine)	5.96	Positive	310.3	310.07	311	921) 108 156	28 26 18
17	설파디아진 (Sulfadiazine)	2.63	Positive	250.2	250.05	251	92 108 1561)	26 22 14
18	설파메라진 (Sulfamerazine)	3.33	Positive	264.3	264.06	265	92 108 1561)	24 22 16
19	설파메타진 (Sulfamethazine)	3.87	Positive	278.3	278.08	279	92 124 1861)	28 22 16
20	설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole)	5.02	Positive	253.2	253.05	254	92 108 1561)	26 20 14
21	설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine)	3.97	Positive	280.3	280.06	281	92 108 1561)	30 25 14
22	설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine)	4.45	Positive	280.3	280.06	281	92 108 1561)	28 24 16
23	설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline)	5.98	Positive	300.3	300.06	301	92 108 1561)	22 22 17
24	설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazin, Sulfaclozine)	4.66	Positive	284.7	284.01	285	92 108 1561)	26 24 14
25	설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine)	5.85	Positive	284.7	284.01	285	92 108 1561)	24 22 14
26	설파티아졸 (Sulfathiazole)	2.91	Positive	255.3	255.01	256	921) 108 156	24 22 15
27	설파페나졸 (Sulfaphenazole)	6.08	Positive	314.4	314.08	315	92 1581) 160	34 28 22
28	설피속사졸 (Sulfisoxazole)	5.33	Positive	267.3	267.06	268	92 1131) 156	31 16 14
29	세파드록실 (Cefadroxil)	1.60	Positive	363.4	363.08	364	1141) 208	15 10
30	세팔렉신 (Cefalexin)	3.14	Positive	347.4	347.09	348	106 1581) 174	26 10 14
31	세프티오퍼 (Ceftiofur)	5.57	Positive	523.6	523.02	524	95 125 2411)	42 58 16
31-1	데스후로일세프티오퍼 (Desfuroylceftiofur)	4.55	Positive	429.5	429.02	430	1281) 259 368	25 18 15
32	스피라마이신 (Spiramycin)	4.55	Positive	843.1	842.51	422	101 142 1741)	12 10 18
33	시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	3.40	Positive	331.3	331.13	332	204 231 2451)	53 35 19
34	아목시실린 (Amoxicillin)	1.39	Positive	365.4	365.10	366	113 133 3491)	19 31 5
35	암피실린 (Ampicillin)	3.12	Positive	349.4	349.11	350	79 1061) 114	44 17 30
36	에리스로마이신 (Erythomycin)	6.16	Positive	733.9	733.46	734	82 1581) 576	35 25 18
37	에토파베이트 (Ethopabate)	5.84	Positive	237.2	237.10	238	136 164 2061)	25 20 10
37-1	m-페네티딘 (m-phenetidine)	3.04	Positive	137.1	137.08	138	65 93 1101)	20 25 10
38	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	3.71	Positive	359.4	359.16	360	189 2451) 286	40 23 32
39	오르메토프림 (Ormethoprim)	3.48	Positive	274.3	274.14	275	81 1231) 259	43 25 27
40	오플록사신 (Ofloxacin)	3.29	Positive	361.4	361.14	362	221 2611) 318	35 28 15
41	옥소린산 (Oxolinic acid)	5.45	Positive	261.2	261.06	262	129 1601) 173	35 28 17
42	옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	3.41	Positive	460.4	460.14	461	201 337 4261)	18 40 28
43	올레안도마이신 (Oleandomycin)	5.83	Positive	687.9	687.41	688	116 1581) 544	40 25 15
44	조사마이신 (Josamycin)	7.59	Positive	828.0	827.46	828	83 1091) 174	40 45 34
45	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	5.61	Negative	323.1	322.01	321	1521) 194 257	18 12 10
46	클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline)	4.77	Positive	478.9	478.11	479	98 1541) 444	40 24 22
47	클록사실린 (Cloxacillin)	7.89	Positive	435.9	435.06	436	159 178 3211)	10 20 15
48	클린다마이신 (Clindamycin)	4.98	Positive	425.0	424.17	426	1261) 335 377	25 18 15
49	키타사마이신 (Kitasamycin)	6.93	Positive	785.9	701.40	772	83 1091) 174	45 38 30
50	테트라싸이클린 (Tetracycline)	3.72	Positive	444.4	444.15	445	1541) 225 410	24 50 16
51	트리메토프림 (Trimethoprim)	3.18	Positive	290.3	290.13	291	123 2301) 261	30 18 25
52	트리클로르폰 (Trichlorfon)	4.28	Positive	257.4	255.92	259	79 1091) 223	25 18 10
53	티아물린 (Tiamulin)	6.91	Positive	493.7	493.32	494	73 1191) 192	50 40 20
54	티아벤다졸 (Thiabendazole)	2.72	Positive	201.2	201.04	202	92 131 1751)	30 25 25
54-1	5-하이드록시 티아벤다졸 (5-hydroxy thiabendazole)	1.91	Positive	217.2	217.03	218	81 108 1471)	35 30 25
55	티암페니콜 (Thiamphenicol)	3.70	Positive	356.2	355.00	354	185 240 2901)	20 16 12
56	틸미코신 (Tilmicosin)	5.39	Positive	869.1	868.56	870	88 126 1741)	60 55 45
57	페노뷰카브 (Fenobucarb)	8.63	Positive	207.2	207.13	208	57 95 1521)	15 15 5
58	페플록사신 (Pefloxacin)	3.34	Positive	333.3	333.14	334	2331) 290 316	23 16 18
59	푸마길린 (Fumagillin)	9.27	Positive	458.5	458.23	459	1311) 177 233	25 15 12
60	프라지콴텔 (Praziquantel)	8.12	Positive	312.4	312.18	313	83 174 2031)	22 28 14
61	플로르페니콜 (Florfenicol)	5.14	Negative	358.2	357.00	356	118 1851) 336	40 21 13
61-1	플로르페니콜 아민 (Florfenicol amine)	1.11	Positive	247.2	247.06	248	91 130 2301)	42 25 10
62	플루메퀸 (Flumequine)	7.03	Positive	261.2	261.08	262	991) 126 202	54 44 30

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

(단위: mg/kg)

구분		정량한계
계열	동물용의약품	넙치	장어	새우
린코사마이드계	린코마이신	0.001	0.001	-
	클린다마이신	0.005	0.005	-
마크로라이드계	스피라마이신	-	-	-
	에리스로마이신	0.001	0.001	-
	올레안도마이신	0.01	0.01	0.01
	조사마이신	0.001	0.001	0.001
	틸미코신	0.01	0.01	0.01
	키타사마이신	-	-	-
벤조이미다졸계	메벤다졸	0.01	0.01	0.01
	메벤다졸 아민	0.01	0.01	0.01
	5-하이드록시 메벤다졸	0.01	0.01	0.01
	티아벤다졸	0.01	0.01	0.01
	5-하이드록시 티아벤다졸	0.01	0.01	0.01
설파계	설파구아니딘	0.005	0.005	0.005
	설파독신	0.001	0.001	0.001
	설파디메톡신	0.001	0.001	0.001
	설파디아진	0.001	0.001	0.001
	설파메라진	0.001	0.001	0.001
	설파메타진	0.001	0.001	0.001
	설파메톡사졸	0.001	0.001	0.001
	설파메톡시피리다진	0.001	0.001	0.001
	설파모노메톡신	0.001	0.001	0.001
	설파퀴녹살린	0.001	0.001	0.001
	설파클로르피리다진	0.001	0.001	0.001
	설파클로르피라진	0.001	0.001	0.001
	설파티아졸	0.001	0.001	0.001
	설파페나졸	0.001	0.001	0.001
	설피속사졸	0.001	0.001	0.001
세팔로스포린계	세파드록실	0.001	0.001	-
	세팔렉신	0.005	0.005	0.005
	세프티오퍼	-	-	-
	데스후로일세프티오퍼	-	-	-
퀴놀론계	날리딕스산	0.0001	0.0001	0.0001
	노르플록사신	0.0007	0.0007	0.0007
	다노플록사신	0.01	0.01	0.01
	디플록사신	0.001	-	-
	마보플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	시프로플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	엔로플록사신	0.0001	0.0001	0.0001
	오플록사신	0.0002	0.0002	0.0002
	옥소린산	0.0001	-	0.0001
	페플록사신	0.0007	0.0007	0.0007
	플루메퀸	-	-	-
테트라싸이클린계	독시싸이클린	0.005	0.005	0.005
	옥시테트라싸이클린	0.001	0.001	0.001
	클로르테트라싸이클린	0.001	0.001	0.001
	테트라싸이클린	0.001	-	0.001
	미노싸이클린	0.01	-	0.01
페니실린계	벤질페니실린	0.01	0.01	0.01
	아목시실린	0.005	-	-
	암피실린	0.005	0.005	0.005
	클록사실린	0.01	0.01	0.01
페니콜계	플로르페니콜	-	-	-
	플로르페니콜 아민	-	-	-
	티암페니콜	-	-	-
	클로람페니콜	-	-	-
기타	데하이드로콜산	0.005	0.005	0.005
	디아베리딘	0.01	0.01	0.01
	비치오놀	-	-	-
	에토파베이트	0.01	0.01	0.01
	m-페네티딘	0.01	0.01	0.01
	오르메토프림	-	-	-
	트리메토프림	0.001	0.001	0.001
	트리클로르폰	0.001	0.001	-
	티아물린	0.001	0.001	-
	페노뷰카브	0.001	0.001	0.001
	푸마길린	-	-	-
	프라지콴텔	0.001	0.001	0.001

※ 정성만 가능한 물질은 ‘-’로 표시

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

1) 정성 및 확인시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 위 바. 4)항에 정량한계가 제시된 물질에 한해서에 따르거나 식품공전 8.3의 정량시험법에 따라 정량한다. 단, 부적합 판정은 8.3의 정량시험법에 의한 결과가 우선한다.

2) 바. 4)항의 정량이 가능한 동물용의약품(정량한계 표시)의 경우, 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3 정량시험법

8.3.1 축·수산물 중 동물용의약품 동시 다성분 시험법

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다(다만, 축산물에서 푸마길린, 수산물에서 디미나진, 메토밀 및 테트라메트린은 제외한다.).

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액으로 추출하고 C18과 아세트니트릴 포화 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 [표 1]의 용매를 참조하여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) C18 분말: 잔여 실란올기가 제거된 C18 분말(55～105 μm, 125 Å) 또는 이와 동등한 것

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

9) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

표 1. 표준원액 조제 용매

- 제 1그룹

용매	대상 동물용의약품
메탄올	날리딕스산, 노르플록사신, 다노플록사신, 데하이드로콜산, 독시싸이클린, 디아베리딘, 디플록사신, 레바미졸, 록시스로마이신, 리팍시민, 린코마이신, 마보플록사신, 멜록시캄, 미노싸이클린, 비치오놀, 사라플록사신, 설파구아니딘, 설파독신, 설파디메톡신, 설파디아진, 설파메라진, 설파메타진, 설파메톡사졸, 설파메톡시피리다진, 설파모노메톡신, 설파퀴녹살린, 설파클로르피라진, 설파클로르피리다진, 설파티아졸, 설파페나졸, 설피속사졸, 스피라마이신, 2-아미노 플루벤다졸, 알벤다졸, 에리스로마이신, 에토파베이트, m-페네티딘, 엔로플록사신, 오비플록사신, 오플록사신, 옥스펜다졸 설폰, 옥시테트라싸이클린, 올레안도마이신, 조사마이신, 클로람페니콜, 클로르테트라싸이클린, 클린다마이신, 키타사마이신, 타일로신, 테트라미졸, 테트라싸이클린, 툴라스로마이신, 트리메토프림, 트리클라벤다졸, 케토트리클라벤다졸, 트리클로르폰, 티아물린, 티아벤다졸, 티암페니콜, 틸디피로신, 틸미코신, 페노뷰카브, 페반텔, 페플록사신, 푸마길린, 프라지콴텔, 플로르페니콜, 플로르페니콜 아민, 플루닉신, 5-하이드록시 플루닉신, 플루메퀸
50% 아세토니트릴	나프실린, 세파드록실, 세팔렉신, 세프티오퍼, 데스후로일 세프티오퍼, 옥사실린, 페니실린 V,
물	디클록사실린, 벤질페니실린, 아목시실린, 암피실린, 오르메토프림, 옥소린산, 클록사실린
DMSO	메벤다졸, 메벤다졸 아민, 5-하이드록시 메벤다졸, 시프로플록사신, 알벤다졸 설폭사이드, 알벤다졸 설폰, 2-아미노 알벤다졸 설폰, 옥스펜다졸, 옥시벤다졸, 펜벤다졸, 플루벤다졸, 5-하이드록시 티아벤다졸

용매	대상 동물용의약품
메탄올	난드롤론, 날록손, 노보비오신, 답손, 모노아세틸 답손, 더콴텔, 2-하이드록시메틸-1-메틸-5-니트로이미다졸, 디메트리다졸, 디미나진, 디에틸카바마진, 디펜하이드라민, 락토파민, 로니다졸, 로베니딘, 로페라미드, 록사손, 메토밀, 메토크로프라미드, 메트로니다졸, 메트로니다졸-OH, 모란텔, 발네물린, 버지니아마이신, 베르베린, 시프로헵타딘, 석시닐-설파티아졸, 설파모졸, 설파미터, 설파벤자미드, 설파세타미드, 설파피리딘, 설피소미딘, 설피린, 스코폴라민, 아세트아닐라이드, 아자페론, 아자페롤, 아크리플라빈, 알트레노제스트, 에마멕틴, 염산메틸에페드린, 올라퀸독스, 요힘빈, 이미도캅, 이소메타미디움, 이프로니다졸, 이프로니다졸-OH, 질파테롤, 카라졸롤, 카벤다짐, 케토프로펜, 쿠마포스, 쿠마포스 옥손, 콜치신, 클렌부테롤, 클로르프로마진, 테트라메트린, 테트라크로르빈포스, 톨트라주릴 설폰, 트리페레나민, 티니다졸, 펄리마이신, 페나세틴, 프로폭서, 플루아주론, 피리메타민, 할로푸지논
50% 아세토니트릴	세파졸린, 세포페라존
아세토니트릴	에프로토마이신, 클로술론
물	바시트라신, 옥시클로자니드
DMSO	나이카바진, 디클라주릴, 안티피린, 카바독스, 클로산텔, 클로피돌

- 제 2그룹

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 4,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액 모두를 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. C18 분말 500 mg과 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞은 후 4,800 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리한다. 분말을 제외한 하층액 중 5 mL를 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣고 녹인 후, 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 폴리프로필렌 바이알에 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
0.5	95	5
5.5	40	60
6.0	0	100
10.0	0	100
10.2	95	5
12.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 3.6 kV(Positive), 2.8 kV(Negative)

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

(1) 제 1그룹

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact Mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision Energy, eV)
1	나프실린 (Nafcillin)	6.86	Positive	414.5	414.1	415.1	115.1	55
							171.2	36
							199.21)	16
2	날리딕스산 (Nalidixic acid)	6.22	Positive	232.2	232.1	233.0	104.01)	42
							131.0	36
							159.0	32
3	노르플록사신 (Norfloxacin)	3.88	Positive	319.3	319.1	320.0	205.0	32
							256.1	22
							233.11)	24
4	다노플록사신 (Danofloxacin)	4.02	Positive	357.4	357.1	357.9	96.0	25
							314.0	19
							340.01)	24
5	데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)	6.35	Negative	402.5	402.2	401.1	214.9	35
							249.0	33
							331.31)	25
6	독시싸이클린 (Doxycycline)	4.86	Positive	444.4	444.2	445.1	154.3	31
							321.2	30
							428.21)	19
7	디아베리딘 (Diaveridine)	3.74	Positive	260.2	260.1	261.0	81.1	43
							123.1	23
							245.11)	27
8	디클록사실린 (Dicloxacillin)	7.04	Positive	470.3	469.0	469.7	114.01)	40
							160.0	16
							311.0	15
9	디플록사신 (Difloxacin)	4.45	Positive	399.4	399.1	400.0	279.1	38
							284.9	32
							299.01)	29
10	레바미졸 (Levamisole)	3.76	Positive	204.2	204.1	205.1	91.1	40
							123.1	35
							178.11)	25
11	록시스로마이신 (Roxithromycin)	5.96	Positive	837.0	836.5	837.4	116.3	47
							158.31)	34
							679.5	22
12	리팍시민 (Rifaximin)	7.20	Positive	785.9	785.4	786.2	123.2	44
							151.2	34
							754.41)	23
13	린코마이신 (Lincomycin)	3.62	Positive	406.5	406.2	407.2	126.31)	26
							359.3	18
							389.3	18
14	마보플록사신 (Marbofloxacin)	3.83	Positive	362.4	362.1	363.0	72.11)	24
							319.9	16
							345.0	22
15	메벤다졸 (Mebendazole)	5.78	Positive	295.2	295.1	296.1	77.1	50
							105.0	35
							264.01)	25
	메벤다졸 아민 (Mebendazole amine)	4.60	Positive	237.2	237.1	238.1	77.3	42
							105.21)	36
							133.0	25
	5-하이드록시 메벤다졸 (5-Hydroxy mebendazole)	4.60	Positive	297.3	297.1	298.1	79.3	40
							160.2	33
							266.21)	21
16	멜록시캄 (Meloxicam)	7.05	Positive	351.4	351.0	351.9	72.9	51
							114.91)	22
							140.9	21
17	미노싸이클린 (Minocycline)	3.75	Positive	457.4	457.2	458.1	283.2	45
							352.2	31
							441.31)	20
18	벤질페니실린 (Benzylpenicillin, Penicillin G, Procaine benzylpenicillin)	5.86	Positive	334.4	334.1	335.4	114.0	30
							160.11)	15
							176.1	15
19	비치오놀 (Bithionol)	8.04	Negative	356.0	355.9	354.9	160.71)	23
							162.7	23
							191.7	25
20	사라플록사신 (Sarafloxacin)	4.40	Positive	385.4	385.1	386.0	299.01)	27
							322.1	25
							348.1	34
21	설파구아니딘 (Sulfaguanidine)	1.85	Positive	214.2	214.1	215.0	60.1	14
							95.11)	26
							156.0	14
22	설파독신 (Sulfadoxine)	5.18	Positive	310.3	310.1	311.0	92.0	30
							108.0	25
							156.01)	19
23	설파디메톡신 (Sulfadimethoxine)	5.75	Positive	310.3	310.1	311.0	92.0	34
							108.01)	31
							156.0	21
24	설파디아진 (Sulfadiazine)	3.82	Positive	250.2	250.1	251.0	92.0	27
							108.01)	23
							155.9	15
25	설파메라진 (Sulfamerazine)	4.25	Positive	264.3	264.1	265.0	92.0	28
							108.0	26
							156.01)	16
26	설파메타진 (Sulfamethazine)	4.54	Positive	278.3	278.1	279.0	92.01)	32
							124.0	24
							186.0	18
27	설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole)	5.25	Positive	253.2	253.1	254.0	92.01)	28
							108.0	23
							155.9	15
28	설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine)	4.56	Positive	280.3	280.1	281.0	92.0	30
							108.0	27
							156.01)	17
29	설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine)	4.85	Positive	280.3	280.1	281.0	92.0	28
							108.0	27
							156.01)	17
30	설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline)	5.66	Positive	300.3	300.1	301.0	108.0	27
							156.01)	19
							208.0	17
31	설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazine, Sulfaclozine)	5.66	Positive	284.7	284.0	285.0	92.1	27
							108.1	25
							130.11)	20
32	설파클로르피리다진 (Sulfachlorpyridazine)	5.04	Positive	284.7	284.0	285.0	92.1	27
							108.1	23
							156.11)	14
33	설파티아졸 (Sulfathiazole)	3.94	Positive	255.3	255.0	256.0	92.0	27
							108.0	24
							156.01)	14
34	설파페나졸 (Sulfaphenazole)	5.77	Positive	314.4	314.1	315.1	92.1	34
							131.1	28
							158.11)	22
35	설피속사졸 (Sulfisoxazole)	5.39	Positive	267.3	267.1	268.0	92.0	27
							113.0	16
							155.91)	15
36	세파드록실 (Cefadroxil)	3.25	Positive	363.4	363.1	364.1	86.2	47
							114.21)	20
							208.2	10
37	세팔렉신 (Cefalexin)	3.84	Positive	347.4	347.1	348.0	106.1	30
							158.01)	13
							174.0	15
38	세프티오퍼 (Ceftiofur)	5.23	Positive	523.6	523.0	524.0	125.0	53
							241.01)	20
							285.0	18
	데스후로일 세프티오퍼 (Desfuroylceftiofur)	4.35	Positive	429.5	429.0	430.0	126.01)	29
							227.0	24
							241.1	16
39	스피라마이신 (Spiramycin)	4.38	Positive	843.1	842.5	843.5	101.1	46
							174.11)	38
							142.1	36
40	시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	3.95	Positive	331.3	331.1	332.1	231.2	36
							245.2	24
							314.21)	20
41	아목시실린 (Amoxicillin)	3.11	Positive	365.4	365.1	365.8	114.0	27
							134.0	30
							349.11)	10
42	알벤다졸 (Albendazole)	5.77	Positive	265.3	265.1	266.1	131.1	48
							159.1	37
							191.11)	31
	알벤다졸 설폭사이드 (Albendazole sulfoxide)	4.29	Positive	281.3	281.1	282.0	159.1	40
							208.11)	23
							240.1	13
	알벤다졸 설폰 (Albendazole sulfone)	5.07	Positive	297.3	297.1	297.6	159.1	37
							224.1	26
							266.11)	20
	2-아미노 알벤다졸 설폰 (2-Aminoalbendazole sulfone)	3.74	Positive	239.3	239.1	240.0	105.1	51
							133.1	18
							198.11)	28
43	암피실린 (Ampicillin)	3.81	Positive	349.4	349.1	350.0	79.1	52
							106.01)	22
							114.0	33
44	에리스로마이신 (Erythromycin)	5.33	Positive	733.9	733.5	734.1	116.0	43
							158.11)	30
							576.2	20
45	에토파베이트 (Ethopabate)	5.59	Positive	237.2	237.1	238.0	136.11)	28
							164.1	19
							206.1	11
	m-페네티딘 (m-phenetidine)	3.99	Positive	137.1	137.1	138.3	65.2	25
							93.2	21
							110.21)	16
46	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	4.14	Positive	359.4	359.2	360.1	203.0	37
							245.01)	28
							285.9	34
47	오르메토프림 (Ormethoprim)	4.07	Positive	274.3	274.1	275.1	81.0	46
							123.0	28
							258.91)	24
48	오비플록사신 (Orbifloxacin)	4.24	Positive	395.4	395.1	396.0	253.91)	31
							295.0	25
							352.1	19
49	오플록사신 (Ofloxacin)	3.90	Positive	361.4	361.1	362.0	205.0	42
							218.9	39
							261.01)	27
50	옥사실린 (Oxacillin)	6.47	Positive	401.4	401.1	401.8	114.01)	36
							160.0	15
							243.1	15
51	옥소린산 (Oxolinic acid)	5.45	Positive	261.2	261.1	262.0	160.0	37
							216.0	29
							244.01)	18
52	옥스펜다졸 (Oxfendazole)	4.95	Positive	315.3	315.1	316.0	159.11)	30
							191.1	21
							283.1	19
	옥스펜다졸 설폰 (Oxfendazole sulfone)	5.74	Positive	331.3	331.1	332.0	131.1	50
							159.1	39
							300.01)	22
53	옥시벤다졸 (Oxibendazole)	5.00	Positive	249.2	249.1	250.0	148.1	35
							176.1	30
							218.11)	20
54	옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	4.01	Positive	460.4	460.1	461.2	201.2	37
							426.21)	20
							443.2	12
55	올레안도마이신 (Oleandomycin)	5.16	Positive	687.9	687.4	688.4	116.1	45
							158.11)	28
							544.3	18
56	조사마이신 (Josamycin)	6.19	Positive	828.0	827.5	828.1	83.1	51
							109.11)	42
							174.1	34
57	클로람페니콜 (Chloramphenicol)	5.45	Negative	323.1	322.0	321.0	120.9	30
							152.21)	16
							257.9	11
58	클로르테트라 싸이클린 (Chlortetracycline)	4.74	Positive	478.9	478.1	479.1	98.0	43
							154.01)	30
							443.9	22
59	클록사실린 (Cloxacillin)	6.77	Positive	435.9	435.3	436.1	114.2	38
							160.21)	33
							178.1	18
60	클린다마이신 (Clindamycin)	4.73	Positive	425.0	424.2	424.9	82.8	55
							126.11)	29
							377.1	21
61	키타사마이신 (Kitasamycin)	5.76	Positive	828.0	771.4	772.4	83.2	50
							109.11)	45
							174.1	35
62	타일로신 (Tylosin A)	5.44	Positive	916.1	915.5	916.4	101.2	49
							174.31)	38
							772.5	31
63	테트라미졸 (Tetramisole)	3.76	Positive	204.2	204.1	205.1	91.2	27
							123.2	37
							178.21)	20
64	테트라싸이클린 (Tetracycline)	4.21	Positive	444.4	444.2	445.1	154.2	27
							410.21)	20
							427.2	14
65	툴라스로마이신 (Tulathromycin)	3.83	Positive	806.1	805.6	403.7	72.31)	26
							116.3	24
							158.3	21
66	트리메토프림 (Trimethoprim)	3.91	Positive	290.3	290.1	291.1	123.0	26
							230.01)	24
							261.0	26
67	트리클라벤다졸 (Triclabendazole)	7.58	Positive	359.7	358.0	359.0	171.1	53
							274.0	37
							346.01)	26
	케토 트리클라벤다졸 (Keto triclabendazole)	7.19	Negative	329.6	328.0	327.0	118.0	40
							146.1	33
							182.21)	25
68	트리클로르폰 (Trichlorfon, Metrifonate)	4.70	Positive	257.4	255.9	256.9	79.1	30
							109.21)	20
							223.0	10
69	티아물린 (Tiamulin)	5.96	Positive	493.7	493.3	494.0	73.0	55
							119.01)	39
							191.9	25
70	티아벤다졸 (Thiabendazole)	3.72	Positive	201.2	201.0	201.9	65.1	45
							131.1	35
							175.01)	25
	5-하이드록시 티아벤다졸 (5-Hydroxy thiabendazole)	3.38	Positive	217.2	217.0	217.9	81.1	45
							147.0	35
							191.01)	25
71	티암페니콜 (Thiamphenicol)	4.38	Negative	356.2	355.0	353.9	185.11)	21
							240.1	16
							290.0	13
72	틸디피로신 (Tildipirosin)	5.33	Positive	734.0	733.5	734.5	88.1	55
							98.01)	41
							174.1	39
73	틸미코신 (Tilmicosin)	4.79	Positive	869.1	868.6	869.7	88.2	60
							174.31)	55
							696.5	45
74	페노뷰카브 (Fenobucarb)	7.28	Positive	207.2	207.1	208.1	77.1	36
							95.21)	16
							152.2	10
75	페니실린 V (Penicillin V)	6.27	Negative	350.4	350.1	349.1	93.1	30
							114.0	20
							208.11)	10
76	페반텔 (Febantel)	7.41	Positive	446.5	446.1	447.0	281.2	32
							384.21)	20
							416.2	14
77	페플록사신 (Pefloxacin)	3.93	Positive	333.3	333.1	334.1	233.2	26
							290.3	17
							316.31)	21
78	펜벤다졸 (Fenbendazole)	6.49	Positive	299.3	299.1	300.0	104.1	55
							131.1	48
							268.11)	21
79	푸마길린 (Fumagillin)	7.43	Positive	458.5	458.2	459.2	103.2	50
							131.11)	28
							177.1	17
80	프라지콴텔 (Praziquantel)	6.97	Positive	312.4	312.2	313.1	83.1	28
							174.0	25
							203.11)	17
81	플로르페니콜 (Florfenicol)	5.29	Negative	358.2	357.0	355.9	151.8	19
							185.1	16
							336.01)	10
	플로르페니콜 아민 (Florfenicol amine)	1.18	Positive	247.2	247.1	248.0	91.1	49
							130.1	23
							230.11)	12
82	플루닉신 (Flunixin)	7.19	Positive	296.2	296.1	297.1	109.1	48
							236.1	42
							264.11)	32
	5-하이드록시 플루닉신 (5-Hydroxy flunixin)	6.78	Positive	312.2	312.2	312.9	279.91)	34
							295.0	23
							266.9	13
83	플루메퀸 (Flumequin)	6.31	Positive	261.2	261.1	262.0	126.0	50
							202.0	33
							244.01)	18
84	플루벤다졸 (Flubendazole)	6.02	Positive	313.2	313.1	314.0	95.1	50
							123.1	35
							282.11)	24
	2-아미노 플루벤다졸 (2-Amino flubendazole)	4.78	Positive	255.2	255.1	256.0	75.1	55
							95.11)	39
							133.1	37

1) 정량이온

(2) 제 2그룹

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact Mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision Energy, eV)
1	난드롤론 (Nandrolone)	6.80	Positive	274.4	274.2	275.1	109.11)	26
							257.2	16
							239.2	17
2	날록손 (Naloxone)	3.53	Positive	327.4	327.1	328.0	212.01)	40
							253.1	27
							268.0	27
3	노보비오신 (Novobiocin)	7.57	Positive	612.6	612.2	612.9	133.01)	53
							189.0	28
							218.0	15
4	나이카바진 (Nicarbazin, N,N‘-bis-(4-nitrophenyl)urea)	7.25	Negative	426.4	302.1	301.1	46.1	55
							107.1	35
							137.21)	14
5	답손 (Dapsone)	4.91	Positive	248.3	248.1	249.0	92.01)	25
							108.1	22
							156.0	14
	모노아세틸답손 (Monoacetyl dapsone)	5.06	Positive	290.3	290.1	291.0	92.01)	30
							108.1	23
							156.1	17
6	더콴텔 (Derquantel)	5.42	Positive	479.6	479.3	480.0	148.3	42
							405.3	31
							462.21)	26
7	디메트리다졸 (Dimetridazole)	3.88	Positive	141.1	141.1	142.1	81.1	26
							95.1	23
							96.11)	15
	2-하이드록시메틸-1-메틸-5- 니트로이미다졸 (2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole (HMMNI))	3.51	Positive	157.1	157.0	158.0	42.1	34
							55.1	19
							140.11)	15
8	디미나진 (Diminazene)	3.05	Positive	281.3	281.1	282.0	102.1	37
							119.11)	17
							254.2	9
9	디에틸카바마진 (Diethylcarbamazine)	3.34	Positive	199.2	199.2	200.1	72.01)	24
							100.1	16
							127.0	15
10	디클라주릴 (Diclazuril)	7.46	Negative	407.6	406.0	405.0	299.0	28
							334.01)	19
							335.1	19
11	디펜하이드라민 (Diphenhydramine)	5.48	Positive	255.3	255.2	256.1	115.0	55
							152.0	35
							167.11)	13
12	락토파민 (Ractopamine)	4.10	Positive	301.4	301.2	302.1	107.01)	34
							121.0	23
							284.1	13
13	로니다졸 (Ronidazole)	3.84	Positive	200.1	200.1	201.0	55.01)	23
							110.0	18
							140.0	12
	2-하이드록시메틸-1-메틸-5- 니트로이미다졸 (2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole (HMMNI))	3.51	Positive	157.1	157.0	158.0	42.1	34
							55.1	19
							140.11)	15
14	로베니딘 (Robenidine)	6.50	Positive	334.2	333.1	333.9	111.0	50
							138.0	25
							155.11)	20
15	로페라미드 (Loperamide)	6.50	Positive	477.0	476.2	477.0	72.0	51
							210.0	51
							266.01)	25
16	록사손 (Roxarsone)	3.33	Negative	263.0	262.9	262.0	123.1	25
							153.1	20
							244.01)	11
17	메토밀 (Methomyl)	4.30	Positive	162.2	162.0	163.2	73.1	27
							88.21)	9
							106.1	11
18	메토크로프라미드 (Metoclopramide)	4.27	Positive	299.7	299.1	299.8	140.91)	49
							184.0	31
							226.9	20
19	메트로니다졸 (Metronidazole)	3.47	Positive	171.1	171.1	171.8	82.01)	25
							98.0	22
							111.0	23
	메트로니다졸-OH (Metronidazole-OH)	3.14	Positive	187.1	187.1	188.0	68.1	22
							123.11)	13
							126.0	17
20	모란텔 (Morantel)	4.64	Positive	220.3	220.1	221.2	111.11)	25
							123.0	35
							164.0	25
21	바시트라신 (Bacitracin)	4.74	Positive	1422.7	1421.7	475.2	86.11)	22
							110.1	49
							199.1	28
22	발네물린 (Valnemulin)	6.11	Positive	564.8	564.4	565.0	147.01)	39
							164.0	32
							263.1	19
23	버지니아마이신 (VirginiamycinM1)	6.55	Positive	525.5	525.2	525.9	109.1	34
							133.0	28
							355.11)	19
24	베르베린 (Berberine)	5.32	Positive	336.4	336.1	336.0	263.01)	53
							278.0	43
							304.0	33
25	석시닐-설파티아졸 (Succinyl-sulfathiazole)	4.18	Positive	355.4	355.0	356.0	108.1	27
							192.1	24
							256.1)	17
26	설파모졸 (Sulfamoxol)	4.37	Positive	267.3	267.1	268.1	92.1	25
							108.1	25
							156.01)	15
27	설파미터 (Sulfameter)	4.62	Positive	280.3	280.1	281.1	92.1	30
							108.1	25
							156.11)	19
28	설파벤자미드 (Sulfabenzamide)	5.66	Positive	276.3	276.1	277.1	92.1	25
							108.1	21
							156.01)	15
29	설파세타미드 (Sulfacetamide)	3.65	Positive	214.2	214.0	215.1	92.1	23
							108.1	21
							156.01)	11
30	설파피리딘 (Sulfapyridine)	4.11	Positive	249.2	249.1	250.1	92.1	26
							108.1	25
							156.01)	16
31	설피소미딘 (Sulfisomidine)	3.56	Positive	278.3	278.1	279.1	92.1	30
							124.11)	20
							186.1	20
32	설피린 (Sulpyrine, Dipyrone, Metamizole, 4-methylamino antipyrine)	3.43	Positive	351.3	217.1	218.1	56.11)	25
							97.1	13
							187.1	11
33	세파졸린 (Cefazolin)	4.39	Positive	454.5	454.0	454.7	155.91)	18
							294.9	17
							323.0	13
34	세포페라존 (Cefoperazone)	4.78	Positive	645.7	645.1	645.8	143.01)	36
							148.0	52
							530.0	12
35	스코폴라민 (Scopolamine)	3.85	Positive	303.3	303.1	303.8	103.01)	38
							138.0	22
							156.0	17
36	시프로헵타딘 (Cyproheptadine)	5.86	Positive	287.4	287.2	288.2	96.11)	25
							191.1	30
							215.1	48
37	아세트아닐라이드 (Acetanilide)	4.92	Positive	135.1	135.1	135.9	43.0	31
							51.0	50
							77.01)	30
38	아자페론 (Azaperone)	4.35	Positive	327.4	327.2	328.2	95.1	64
							121.1	19
							123.11)	44
	아자페롤 (Azaperol)	4.05	Positive	329.4	329.2	330.2	109.1	57
							121.11)	20
							149.1	30
39	아크리플라빈 (Acriflavine, Euflavine)	4.24	Positive	469.0	224.1	223.9	154.01)	54
							164.9	48
							209.0	27
40	안티피린 (Antipyrine, Phenazone)	4.58	Positive	188.2	188.1	188.9	56.01)	34
							58.5	34
							104.0	25
41	알트레노제스트 (Altrenogest)	7.40	Positive	310.4	310.2	311.0	227.11)	24
							269.1	15
							293.4	18
42	에마멕틴 (Emamectin benzoate)	7.38	Positive	1008.2	885.5	886.2	82.1	55
							126.2	43
							158.01)	35
43	에프로토마이신 (Efrotomycin)	7.10	Negative	1145.3	1144.6	1143.6	274.2	49
							773.4	34
							791.31)	27
44	염산메틸에페드린 (DL-methylephedrine HCl)	3.70	Positive	179.2	179.1	179.9	57.0	19
							117.01)	21
							147.1	22
45	옥시클로자니드 (Oxyclozanide)	7.60	Negative	401.4	400.9	399.9	202.1	22
							363.91)	17
							381.9	22
46	올라퀸독스 (Olaquindox)	4.63	Positive	263.2	188.1	189.0	102.0	32
							143.0	16
							145.01)	16
47	요힘빈 (Yohimbine)	4.69	Positive	354.4	354.2	355.1	117.01)	52
							144.0	31
							212.1	24
48	이미도캅 (Imidocarb)	3.26	Positive	348.4	348.2	349.0	145.1	55
							162.2	25
							188.11)	29
49	이소메타미디움 (Isometamidium)	4.45	Positive	460.6	460.2	460.2	269.1	50
							298.11)	25
							313.1	20
50	이프로니다졸 (Ipronidazole)	5.59	Positive	169.1	169.1	170.1	109.11)	26
							123.1	25
							124.1	19
	이프로니다졸-OH (Ipronidazole-OH)	4.71	Positive	185.1	185.1	186.1	121.1	29
							122.2	20
							168.21)	15
51	질파테롤 (Zilpaterol)	3.12	Positive	261.3	261.1	262.2	185.11)	25
							202.1	19
							244.2	14
52	카라졸롤 (Carazolol)	4.91	Positive	298.4	298.2	299.2	116.11)	21
							194.1	30
							222.1	20
53	카바독스 (Carbadox)	4.42	Positive	262.2	174.0	174.8	102.01)	32
							129.0	18
							131.0	16
54	카벤다짐 (Carbendazim)	3.67	Positive	191.1	191.1	192.0	105.1	35
							132.2	29
							160.11)	18
55	케토프로펜 (Ketoprofen)	6.99	Positive	254.2	254.1	255.1	77.1	45
							105.0	22
							209.11)	15
56	쿠마포스 (Coumaphos)	7.71	Positive	362.8	362.0	363.0	227.01)	25
							307.0	18
							335.0	17
	쿠마포스 옥손 (Coumaphos oxon)	7.08	Positive	346.7	346.0	347.0	291.01)	24
							221.0	33
57	콜치신 (Colchicine)	5.29	Positive	399.4	399.2	400.1	310.2	27
							326.2	24
							358.21)	23
58	클렌부테롤 (Clenbuterol)	4.53	Positive	277.1	276.1	277.0	140.01)	46
							168.0	31
							203.0	17
59	클로르프로마진 (Chlorpromazine)	6.18	Positive	318.9	318.1	319.1	58.1	30
							86.11)	20
							246.0	24
60	클로산텔 (Closantel)	8.55	Negative	663.1	661.9	660.8	127.01)	50
							315.1	34
							345.0	36
61	클로술론 (Clorsulon)	5.60	Negative	380.7	378.9	378.0	277.1	22
							242.2	22
							342.11)	12
62	클로피돌 (Clopidol)	3.73	Positive	192.0	191.0	192.0	51.1	44
							87.1	30
							101.11)	26
63	테트라메트린 (Tetramethrin)	8.02	Positive	331.4	331.2	332.0	135.1	17
							164.11)	24
							314.2	10
64	테트라크로르빈포스 (Tetrachlorvinphos)	7.57	Positive	366.0	365.9	367.0	127.11)	21
							205.9	37
65	톨트라주릴 설폰 (Toltrazuril sulfone)	7.31	Negative	457.4	457.1	456.0	42.21)	22
							399.1	12
66	트리페레나민 (Tripelennamine)	4.83	Positive	255.3	255.2	256.1	72.11)	32
							91.0	36
							119.0	34
67	티니다졸 (Tinidazole)	4.40	Positive	247.2	247.1	248.0	82.1	34
							121.11)	16
							128.0	21
68	펄리마이신 (Pirlimycin)	4.62	Positive	411.0	410.2	411.1	56.1	52
							112.11)	30
							363.1	19
69	페나세틴 (Phenacetin)	5.54	Positive	179.2	179.1	179.9	65.11)	37
							93.0	28
							110.0	22
70	프로폭서 (Propoxur)	6.53	Positive	209.2	209.1	210.1	93.0	24
							111.01)	15
							168.1	9
71	플루아주론 (Fluazuron)	7.85	Positive	506.2	505.0	506.0	158.01)	20
							141.0	48
							349.0	19
72	피리메타민 (Pyrimethamine)	4.95	Positive	248.7	248.1	249.1	177.0	30
							198.1	45
							233.11)	28
73	할로푸지논 (Halofuginone)	4.90	Positive	414.7	413.0	414.0	100.1	24
							120.11)	21
							138.1	20

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

가) 제 1그룹

(단위: mg/kg)

분석성분 (Compound)	식육	알(卵)	유(乳)	어류	갑각류
나프실린 (Nafcillin)	0.002	0.001	0.0007	0.01	0.01
날리딕스산 (Nalidixic acid)	0.0009	0.001	0.001	0.001	0.01
노르플록사신 (Norfloxacin)	0.0007	0.0007	0.0007	0.0007	0.0007
다노플록사신 (Danofloxacin)	0.001	0.0005	0.0003	0.01	0.01
데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)	-	-	-	0.002	0.01
독시싸이클린 (Doxycycline)	0.003	0.0005	0.001	0.001	0.01
디아베리딘 (Diaveridine)	0.001	0.0002	0.0002	0.01	0.01
디클록사실린 (Dicloxacillin)	0.007	0.007	0.003	0.01	0.01
디플록사신 (Difloxacin)	0.0005	0.001	0.0003	0.0003	0.001
레바미졸 (Levamisole)	0.001	0.001	0.0002	0.01	0.01
록시스로마이신 (Roxithromycin)	0.0003	0.0004	0.0002	0.01	0.01
리팍시민 (Rifaximin)	0.0005	0.0002	0.003	0.01	0.01
린코마이신 (Lincomycin)	0.003	0.0002	0.0008	0.001	0.0004
마보플록사신 (Marbofloxacin)	0.002	0.0005	0.0005	0.01	0.01
메벤다졸 (Mebendazole)	0.0003	0.0003	0.0003	0.01	0.01
메벤다졸아민 (Mebendazole amine)	0.0007	0.0005	0.0006	0.01	0.01
5-하이드록시 메벤다졸 (5-Hydroxy mebendazole)	0.0006	0.0003	0.0002	0.01	0.01
멜록시캄 (Meloxicam)	0.0006	0.0005	0.0007	0.01	0.01
미노싸이클린 (Minocycline)	0.002	0.001	0.005	0.01	0.01
벤질페니실린 (Benzylpenicillin, Penicillin G, Procaine benzylpenicillin)	0.005	0.001	0.002	0.01	0.01
비치오놀 (Bithionol)	0.0009	0.0005	0.0005	0.001	0.01
사라플록사신 (Sarafloxacin)	0.0006	0.0006	0.003	0.01	0.01
설파구아니딘 (Sulfaguanidine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파독신 (Sulfadoxine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파디메톡신 (Sulfadimethoxine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파디아진 (Sulfadiazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파메라진 (Sulfamerazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파메타진 (Sulfamethazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파메톡사졸 (Sulfamethoxazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파메톡시피리다진 (Sulfamethoxypyridazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파모노메톡신 (Sulfamonomethoxine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파퀴녹살린 (Sulfaquinoxaline)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파클로르피라진 (Sulfachlorpyrazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파클로르피리다진 (Sulfacholrpyridazine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파티아졸 (Sulfathiazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파페나졸 (Sulfaphenazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설피속사졸 (Sulfisoxazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
세파드록실 (Cefadroxil)	0.002	0.002	0.0009	0.005	0.01
세팔렉신 (Cefalexin)	0.002	0.001	0.005	0.003	0.01
세프티오퍼 (Ceftiofur)	0.002	0.002	0.002	0.002	0.002
데스후로일 세프티오퍼 (Disfuroyl ceftiofur)	-	-	-	-	-
스피라마이신 (Spiramycin)	0.001	0.0004	0.001	0.001	0.003
시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	0.0004	0.002	0.0007	0.002	0.001
아목시실린 (Amoxicillin)	0.002	0.001	0.0004	0.005	0.002
알벤다졸 (Albendazole)	0.0005	0.0004	0.0004	0.01	0.01
알벤다졸 설폭사이드 (Albendazole sulfoxide)	0.0003	0.0003	0.0003	0.01	0.01
알벤다졸 설폰 (Albendazole sulfone)	0.0003	0.0003	0.0003	0.01	0.01
2-아미노 알벤다졸 설폰 (2-Aminoalbendazole sulfone)	0.0003	0.0002	0.0002	0.01	0.01
암피실린 (Ampicillin)	0.001	0.001	0.0007	0.007	0.002
에리스로마이신 (Erythromycin)	0.0003	0.0002	0.0002	0.001	0.001
에토파베이트 (Ethopabate)	0.0005	0.0005	0.0006	0.01	0.01
m-페네티딘 (m-phenetidine)	0.005	0.005	0.0001	0.01	0.01
엔로플록사신 (Enrofloxacin)	0.0004	0.0009	0.0005	0.001	0.0004
오르메토프림 (Ormethoprim)	0.0002	0.0005	0.0001	0.001	0.01
오비플록사신 (Orbifloxacin)	0.004	0.002	0.003	0.01	0.01
오플록사신 (Ofloxacin)	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002
옥사실린 (Oxacillin)	0.004	0.003	0.002	0.01	0.01
옥소린산 (Oxolinic acid)	0.001	0.0006	0.0009	0.01	0.001
옥스펜다졸 (Oxfendazole)	0.002	0.002	0.002	0.01	0.01
옥스펜다졸 설폰 (Oxfendazole sulfone)	0.0004	0.0003	0.0003	0.01	0.01
옥시벤다졸 (Oxibendazole)	0.0004	0.0003	0.0003	0.01	0.01
옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	0.0005	0.007	0.0005	0.0003	0.001
올레안도마이신 (Oleandomycin)	0.005	0.007	0.0008	0.01	0.01
조사마이신 (Josamycin)	0.0004	0.0002	0.0003	0.0003	0.01
클로람페니콜 (Chloramphenicol)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline)	0.005	0.003	0.003	0.003	0.002
클록사실린 (Cloxacillin)	0.001	0.0005	0.002	0.01	0.01
클린다마이신 (Clindamycin)	0.005	0.0003	0.0005	0.0003	0.01
키타사마이신 (Kitasamycin)	0.001	0.0009	0.0006	0.001	0.01
타일로신 (Tylosin A)	0.0005	0.0005	0.0004	0.01	0.01
테트라미졸 (Tetramisole)	0.0006	0.0004	0.0006	0.01	0.01
테트라싸이클린 (Tetracycline)	0.003	0.003	0.0005	0.003	0.002
툴라스로마이신 (Tulathromycin)	0.0006	0.0007	0.0004	0.01	0.01
트리메토프림 (Trimethoprim)	0.0002	0.0005	0.0001	0.001	0.0004
트리클라벤다졸 (Triclabendazole)	0.0004	0.0002	0.0003	0.01	0.01
케토 트리클라벤다졸 (Keto triclabendazole)	0.0006	0.0004	0.001	0.01	-
트리클로르폰 (Trichlorfon, Metrifonate)	0.006	0.001	0.001	0.001	0.01
티아물린 (Tiamulin)	0.0006	0.0006	0.0004	0.0004	0.01
티아벤다졸 (Thiabendazole)	0.0006	0.0003	0.0003	0.01	0.01
5-하이드록시 티아벤다졸 (5-Hydroxy thiabendazole)	0.0002	0.0002	0.0003	0.01	0.01
티암페니콜 (Thiamphenicol)	0.0007	0.0007	0.001	0.001	0.01
틸디피로신 (Tildipirosin)	0.002	0.001	0.003	0.01	0.01
틸미코신 (Tilmicosin)	0.0005	0.0005	0.0005	0.01	0.01
페노뷰카브 (Fenobucarb)	0.001	0.001	0.001	0.001	0.01
페니실린 V (Penicillin V)	0.001	0.001	0.0007	0.01	0.01
페반텔 (Febantel)	0.0003	0.0005	0.0002	0.01	0.01
페플록사신 (Pefloxacin)	0.0007	0.0007	0.0007	0.0007	0.0007
펜벤다졸 (Fenbendazole)	0.0005	0.0003	0.0003	0.01	0.01
푸마길린 (Fumagillin)	-	-	-	0.007	0.01
프라지콴텔 (Praziquantel)	0.001	0.0009	0.0009	0.0009	0.01
플로르페니콜 (Florfenicol)	0.0004	0.0005	0.0005	0.0005	0.001
플로르페니콜 아민 (Florfenicol amine)	-	-	-	-	-
플루닉신 (Flunixin)	0.0004	0.0004	0.0009	0.01	0.01
5-하이드록시 플루닉신 (5-Hydroxy flunixin)	-	-	0.005	-	-
플루메퀸 (Flumequin)	0.0008	0.0005	0.0007	0.0004	0.0004
플루벤다졸 (Flubendazole)	0.0004	0.0002	0.0004	0.01	0.01
2-아미노 플루벤다졸 (2-Amino flubendazole)	0.0009	0.001	0.0007	0.01	0.01

나) 제 2그룹

(단위: mg/kg)

분석성분 (Compound)	식육	알(卵)	유(乳)	어류	갑각류
난드롤론 (Nandrolone)	0.001	0.008	0.001	0.01	0.01
날록손 (Naloxone)	0.0006	0.0009	0.0004	0.01	0.01
노보비오신 (Novobiocin)	0.0013	0.0001	0.0005	0.01	0.01
나이카바진 (Nicarbazin, N,N‘-bis-(4-nitrophenyl)urea)	0.0006	0.005	0.0003	0.01	0.01
답손 (Dapsone)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
모노아세틸답손 (Monoacetyl dapsone)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
더콴텔 (Derquantel)	0.005	0.0003	0.005	-	0.01
디메트리다졸 (Dimetridazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
2-하이드록시메틸-1-메틸-5-니트로이미다졸 (2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole(HMMNI))	0.002	0.002	0.002	0.002	0.002
디미나진 (Diminazene)	0.004	0.004	0.0009	-	-
디에틸카바마진 (Diethylcarbamazine)	0.0004	0.003	0.0004	0.01	0.01
디클라주릴 (Diclazuril)	0.0008	0.0001	0.0002	0.01	0.01
디펜하이드라민 (Diphenhydramine)	0.0002	0.0001	0.0004	0.01	0.01
락토파민 (Ractopamine)	0.0005	0.0002	0.0001	0.01	0.01
로니다졸 (Ronidazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
2-하이드록시메틸-1-메틸-5-니트로이미다졸 (2-hydroxymethyl-1-methyl-5-nitroimidazole(HMMNI))	0.002	0.002	0.002	0.002	0.002
로베니딘 (Robenidine)	0.005	0.0005	0.001	0.01	0.01
로페라미드 (Loperamide)	0.0001	0.0002	0.005	0.01	0.01
록사손 (Roxarsone)	0.004	0.004	0.004	0.002	0.002
메토밀 (Methomyl)	0.003	0.0008	0.0002	-	-
메토크로프라미드 (Metoclopramide)	0.0001	0.0004	0.0002	0.01	0.01
메트로니다졸 (Metronidazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
메트로니다졸-OH (Metronidazole-OH)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
모란텔 (Morantel)	0.002	0.0008	0.002	0.01	0.01
바시트라신 (Bacitracin)	0.005	0.003	0.001	0.01	0.01
발네물린 (Valnemulin)	0.0003	0.0006	0.0002	0.01	0.01
버지니아마이신 (Virginiamycin M1)	0.0007	0.0002	0.0001	0.01	0.01
베르베린 (Berberine)	0.0002	0.0005	0.002	0.01	0.01
석시닐-설파티아졸 (Succinyl-sulfathiazole)	0.005	0.001	0.001	0.001	0.01
설파모졸 (Sulfamoxol)	0.0009	0.0005	0.005	0.0005	0.01
설파미터 (Sulfameter)	0.0009	0.0003	0.0002	0.001	0.01
설파벤자미드 (Sulfabenzamide)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파세타미드 (Sulfacetamide)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설파피리딘 (Sulfapyridine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설피소미딘 (Sulfisomidine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.01
설피린 (Sulpyrine, Dipyrone, Metamizole, 4-methylamino antipyrine)	0.005	0.0003	0.005	0.01	0.01
세파졸린 (Cefazolin)	0.003	0.001	0.002	0.01	0.01
세포페라존 (Cefoperazone)	0.005	0.0004	0.003	0.01	0.01
스코폴라민 (Scopolamine)	0.0007	0.0006	0.0004	0.01	0.01
시프로헵타딘 (Cyproheptadine)	0.0003	0.0001	0.0006	0.01	0.01
아세트아닐라이드 (Acetanilide)	0.001	0.001	0.002	0.01	0.01
아자페론 (Azaperone)	0.0003	0.0001	0.0002	0.01	0.01
아자페롤 (Azaperol)	0.0003	0.0001	0.0002	0.01	0.01
아크리플라빈 (Acriflavine, Euflavine)	0.001	0.002	0.0005	0.01	0.01
안티피린 (Antipyrine, Phenazone)	0.0005	0.0007	0.0004	0.01	0.01
알트레노제스트 (Altrenogest)	0.0003	0.0003	0.0006	0.01	0.01
에마멕틴 (Emamectin benzoate)	0.0001	0.0003	0.0002	0.01	0.01
에프로토마이신 (Efrotomycin)	0.004	0.005	0.0006	0.01	0.01
염산메틸에페드린 (DL-methylephedrine HCl)	0.0004	0.0002	0.0007	0.01	0.01
옥시클로자니드 (Oxyclozanide)	0.0003	0.0002	0.0004	0.01	0.01
올라퀸독스 (Olaquindox)	0.004	0.004	0.004	0.004	0.004
요힘빈 (Yohimbine)	0.0005	0.0004	0.0004	0.01	0.01
이미도캅 (Imidocarb)	0.0003	0.0002	0.0001	0.01	0.01
이소메타미디움 (Isometamidium)	0.004	0.0005	0.005	0.01	0.01
이프로니다졸 (Ipronidazole)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
이프로니다졸-OH (Ipronidazole-OH)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
질파테롤 (Zilpaterol)	0.001	0.0004	0.0001	0.01	0.01
카라졸롤 (Carazolol)	0.0008	0.0004	0.0004	0.01	0.01
카바독스 (Carbadox)	0.004	0.004	0.004	0.004	0.004
카벤다짐 (Carbendazim)	0.0002	0.0004	0.0001	0.01	0.01
케토프로펜 (Ketoprofen)	0.003	0.0005	0.003	0.01	0.01
쿠마포스 (Coumaphos)	0.001	0.0003	0.0009	0.01	0.01
쿠마포스 옥손 (Coumaphos oxon)	-	-	-	-	-
콜치신 (Colchicine)	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005	0.0005
클렌부테롤 (Clebuterol)	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002	0.0002
클로르프로마진 (Chlorpromazine)	0.001	0.001	0.001	0.001	0.001
클로산텔 (Closantel)	0.005	0.005	0.0005	0.01	0.01
클로술론 (Clorsulon)	0.003	0.001	0.0003	0.01	0.01
클로피돌 (Clopidol)	0.005	0.004	0.001	0.01	0.01
테트라메트린 (Tetramethrin)	0.005	0.003	0.005	-	-
테트라크로르빈포스 (Tetrachlorvinphos)	0.003	0.002	0.003	0.01	0.01
톨트라주릴 설폰 (Toltrazuril sulfone)	0.02	0.002	0.01	0.01	0.01
트리페레나민 (Tripelennamine)	0.001	0.0003	0.004	0.01	0.01
티니다졸 (Tinidazole)	0.0008	0.001	0.002	0.01	0.01
펄리마이신 (Pirlimycin)	0.0004	0.0004	0.0001	0.01	0.01
페나세틴 (Phenacetin)	0.0004	0.0005	0.001	0.01	0.01
프로폭서 (Propoxur)	0.0002	0.0003	0.0002	0.01	0.01
플루아주론 (Fluazuron)	0.0004	0.0001	0.0001	0.01	0.01
피리메타민 (Pyrimethamine)	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001
할로푸지논 (Halofuginone)	0.001	0.0002	0.0005	0.01	0.01

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

1) 정성 및 확인시험에서 검출된 잔류동물용의약품은 아래 2)항에 따라 정량한다. 다만, 축산물 중 데하이드로콜산, 세프티오퍼, 플로르페니콜, 쿠마포스, 수산물 중 더콴텔, 세프티오퍼, 트리클라벤다졸, 플로르페니콜, 쿠마포스는 8.3.1 이외의 8.3의 정량시험법에 따라 정량한다.

2) 바. 4)항의 정량이 가능한 동물용의약품(정량한계 표시)의 경우, 위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

✳ 페반텔(FB), 펜벤다졸(FBZ), 옥스펜다졸(OXF)은 옥스펜다졸 설폰(OXF-SO2) 등가치로 환산하여 그 합을 구한다.

[eqn: C _{OFZ-SO _{2}} `=` LEFT ( C _{FBZ} TIMES {M _{OXF-SO _{2}}} over {M _{FBZ}} `+`C _{OXF} TIMES {M _{OXF-SO _{2}}} over {M _{OXF}}]

[eqn: +`C _{OXF-SO _{2}} TIMES {M _{OXF-SO _{2}}} over {M _{OXF-SO _{2}}} ` RIGHT )]

[eqn: =C _{FBZ} TIMES {331} over {299} +C _{OXF} TIMES {331} over {315} +C _{OXF-SO2} TIMES {331} over {331}# =C _{FBZ} TIMES 1.107+C _{OXF} TIMES 1.051+C _{OXF-SO2} TIMES 1`]

* C: 농도(mg/kg), M: 분자량

✳ 메벤다졸(MBZ)은 메벤다졸(MBZ), 메벤다졸 아민(MBZ-NH2,), 5-하이드록시 메벤다졸(5OH-MBZ)을 메벤다졸(MBZ) 등가치로 환산하여 그 합을 구한다.

[eqn: C _{MBZ} `=` LEFT ( C _{MBZ} TIMES {M _{MBZ}} over {M _{MBZ}} `+`C _{MBZ-NH _{2}} TIMES {M _{MBZ}} over {M _{MBZ-NH _{2}}}]

[eqn: `+`C _{5OH-MBZ} TIMES {M _{MBZ}} over {M _{5OH-MBZ}} RIGHT )]

[eqn: =C _{MBZ} TIMES {295} over {295} +C _{MBZ-NH _{2}} TIMES {295} over {237} +C _{5OH-MBZ} TIMES {295} over {297}# =C _{MBZ} TIMES 1+C _{MBZ-NH _{2}} TIMES 1.245+C _{5OH-MBZ} TIMES 0.993`]

* C: 농도(mg/kg), M: 분자량

8.3.2 겐타마이신(Gentamicin), 네오마이신(Neomycin), 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 스펙티노마이신(Spectinomycin), 아미카신(Amikacin), 아프라마이신(Apramycin), 카나마이신(Kanamycin), 파로모마이신(Paromomycin, aminosidine, monomycin), 하이그로마이신 B(Hygromycin B)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상 물질을 2% 삼염화초산 함유 10 mM 아세트산암모늄 수용액으로 추출한 후 C18 분말로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 혼합한 후 물로 희석하여 사용한다.

5) 내부표준물질 표준원액: 토브라마이신 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

6) 내부표준물질 표준용액: 내부표준물질의 표준원액을 물로 희석하여 200 ng/mL가 되게 한다.

7) 2% 삼염화초산 함유 10 mM 아세트산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 0.77 g을 넣고 녹인 후 5 N 염산으로 pH 4.0에 맞추고, Na2EDTA·2H2O 0.15 g, 삼염화초산 20 g, NaCl 5 g을 넣고 녹인 후 물로 표시선까지 채운다.

8) 20 mM Heptafluorobutyric acid(HFBA) 함유 5% 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 아세토니트릴 50 mL와 HFBA 2.6 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

9) 20 mM HFBA 함유 50% 아세토니트릴 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세토니트릴 500 mL와 HFBA 2.6 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

10) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

11) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 내부표준물질(토브라마이신, 200 ng/mL)을 200 μL 첨가하여 15분간 정치한다. 2% 삼염화초산을 함유한 10 mM 아세트산암모늄 용액 5 mL를 넣고 20분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 4,800 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 2 mL 마이크로 원심분리관에 1 mL를 취하여 –20℃에서 20분간 방치한 후 4℃에서 20,000 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 전량 취하여 C18 분말 100 mg이 들어있는 2 mL 마이크로 원심분리관에 넣고 흔들어 섞어 추출한 후 4℃에서 20,000 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하고 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 폴리프로필렌 바이알에 담아 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 20 mM HFBA 함유한 5%(v/v) 아세토니트릴

(2) 이동상 B: 20 mM HFBA 함유한 50%(v/v) 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
0.5	80	20
9.0	5	95
10.0	5	95
10.1	80	20
15.0	80	20

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 400℃

다) Capillary voltage: 1.2 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
겐타마이신 C1 (Gentamicin C1)	6.77	477.6	477.3	478.3	157.1	20
					160.0	22
					322.21)	14
겐타마이신 C1a (Gentamicin C1a)	6.59	449.5	449.3	450.3	112.0	26
					160.0	22
					322.21)	12
겐타마이신 C2 (Gentamicin C2)	6.65	463.6	463.3	464.3	112.0	42
					160.0	20
					322.21)	10
겐타마이신 C2a (Gentamicin C2a)	6.79	463.6	463.3	464.3	112.0	34
					160.0	20
					322.21)	12
네오마이신 (Neomycin)	6.93	614.6	614.3	615.2	160.61)	32
					163.5	32
					293.1	20
디히드로 스트렙토마이신 (Dihydrostreptomycin)	4.10	583.6	583.3	584.2	221.1	36
					246.1	34
					263.11)	28
스트렙토마이신 (Streptomycin)	4.02	581.6	581.3	582.3	221.1	38
					246.1	36
					263.11)	30
스펙티노마이신 (Spectinomycin)	2.97	332.3	332.2	350.9	189.1	25
					207.1	16
					333.21)	22
아미카신 (Amikacin)	4.95	585.6	585.3	586.4	163.11)	34
					264.2	24
					425.2	12
아프라마이신 (Apramycin)	6.14	539.6	539.3	540.3	217.11)	26
					344.1	18
					378.2	16
카나마이신 (Kanamycin)	5.19	484.5	484.2	485.2	163.01)	26
					205.1	32
					324.1	14
파로모마이신 (Paromomycin)	6.93	615.6	615.3	616.3	163.11)	36
					293.1	22
					324.2	20
하이그로마이신 B (Hygromycin B)	3.78	527.5	527.2	528.2	117.11)	28
					257.0	28
					352.1	12
토브라마이신(내부표준물질) (Tobramycin, IS)	6.32	467.5	467.3	468.2	163.01)	24

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

겐타마이신 C1(6.77분)	겐타마이신 C1a(6.59분)
겐타마이신 C2(6.65분)	겐타마이신 C2a(6.79분)
네오마이신(6.93분)	디히드로스트렙토마이신(4.10분)
스트렙토마이신(4.02분)	스펙티노마이신(2.97분)
아미카신(4.95분)	아프라마이신(6.14분)
카나마이신(5.19분)	파로모마이신(6.93분)
하이그로마이신 B(3.78분)	토브라마이신(6.32분)

4) 표준품 크로마토그램

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

(단위: mg/kg)
분석성분 (Compounds)	소고기	돼지고기	닭고기	알(卵)	유(乳)	넙치	장어	새우
겐타마이신 C1 (Gentamicin C1)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C1a (Gentamicin C1a)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C2 (Gentamicin C2)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
겐타마이신 C2a (Gentamicin C2a)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
네오마이신 (Neomycin)	0.01	0.05	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
디히드로 스트렙토마이신 (Dihydrostreptomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.008	0.005	0.005
스트렙토마이신 (Streptomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.008	0.005	0.005
스펙티노마이신 (Spectinomycin)	0.01	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
아미카신 (Amikacin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
아프라마이신 (Apramycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
카나마이신 (Kanamycin)	0.005	0.005	0.005	0.01	0.005	0.005	0.005	0.005
파로모마이신 (Paromomycin)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
하이그로마이신 (Hygromycin B)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.3 나라신(Narasin), 라살로시드(Lasalocid), 마두라마이신(Maduramycin), 모넨신(Monensin), 살리노마이신(Salinomycin), 샘두라마이신(Semduramicin)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 100 mL 메탄올로 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

5) 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2): 500 mL 용량플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 물로 녹여 표시선까지 채운다.

6) 0.3% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 3 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.3% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 3 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 1 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.2 M 인산완충액(pH 7.2) 1 mL를 넣고 흔들어 섞어 추출한 후 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 4℃에서 3,500 ×g로 20분간 원심분리하여 상층액을 취한 후 40℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 50% 아세토니트릴 용액 1 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C8계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.3%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.3%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
10.0	10	90
14.0	10	90
15.0	0	100
25.0	0	100
25.5	50	50
30.0	50	50

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Source temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
나라신 (Narasin)	14.11	765.0	764.5	787.5	431.31)	60
					531.3	50
					413.1	60
라살로시드 (Lasalocid A-Na)	11.71	612.8	612.4	613.2	377.11)	40
					577.1	30
					595.3	30
마두라마이신 (Maduramycin)	15.02	934.2	916.5	939.4	877.41)	30
					895.2	50
					859.0	50
모넨신 (Monensin-Na)	13.15	692.9	692.4	693.3	461.21)	60
					479.2	60
					501.2	60
살리노마이신 (Salinomycin-Na)	12.92	791.0	772.5	773.3	431.21)	60
					531.2	50
					265.2	60
샘두라마이신 (Semduramicin)	10.75	873.1	872.5	895.3	833.41)	30
					851.2	30
					815.1	30

마) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

나라신(14.11분)	라살로시드(11.7분)
마두라마이신(15.0분)	모넨신(13.1분)
살리노마이신(12.9분)	샘두라마이신(10.7분)

4) 표준품 크로마토그램

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

분석성분 (Compounds)	정량한계(mg/kg)
	식육	유(乳)	알(卵)	수산물
나라신(Narasin)	0.01	0.002	0.003	0.002
라살로시드(Lasalocid A-Na)	0.005	0.001	0.01	0.001
마두라마이신(Maduramycin)	0.004	0.002	0.002	0.002
모넨신(Monensin-Na)	0.009	0.002	0.004	0.002
살리노마이신(Salinomycin-Na)	0.008	0.001	0.005	0.002
샘두라마이신(Semduramicin)	0.005	0.002	0.003	0.002

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.4 데코퀴네이트(Decoquinate), 디사이클라닐(Dicyclanil), 암프롤리움(Amprolium), 죠렌(Zoalene)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 해당 용매 주1)(물, 아세토니트릴, 디메틸포름아미드(DMF, Dimethylformamide))에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 혼합한 후 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

주1) 분석대상물질 및 표준원액 제조에 사용되는 용매

No.	동물용의약품	분석대상물질	용매
1	데코퀴네이트(Decoquinate)	Decoquinate	아세토니트릴
2	디사이클라닐(Dicyclanil)	Dicyclanil	디메틸포름아미드(DMF)
3	암프롤리움(Amprolium)	Amprolium	물
4	죠렌(Zoalene)	Zoalene	아세토니트릴
		*3-Amino-5-nitro-o-toluamide(ANOT)

* 표시 물질은 대사체임

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 물 2 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 9,300 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 상층액에 n-헥산 10 mL를 넣고 2분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 9,300 ×g로 10분간 원심분리하여 하층액을 취하고 감압(또는 질소)농축한다. 잔류물에 50% 아세토니트릴 1 mL를 넣어 녹인 후 마이크로 원심분리 튜브에 옮겨 상온에서 15,800 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
1.0	95	5
9.0	5	95
11.0	5	95
11.1	95	5
13.5	95	5

다) 이동상 유량: 0.35 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	데코퀴네이트 (Decoquinate)	9.02	Positive	417.5	417.3	418.2	372.11)	33.0
							203.9	55.0
							231.9	47.0
2	디사이클라닐 (Dicyclanil)	2.10	Positive	190.2	190.1	191.0	150.01)	27.0
							149.8	29.0
							163.1	23.0
3	암프롤리움 (Amprolium)	0.88	Positive	278.7	278.1	243.1	150.01)	17.0
							93.8	19.0
							122.0	31.0
4	죠렌 (Zoalene)	4.98	Negative	225.1	225.0	223.9	181.01)	14.0
							42.0	36.0
							151.0	22.0
	*3-Amino-5-nitro-toluamide(ANOT)	3.46	Positive	195.1	195.1	196.0	107.01)	23.0
							153.1	23.0
							179.0	11.0

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

데코퀴네이트(9.02분)	디사이클라닐(2.10분)
암프롤리움(0.88분)	죠렌(4.98분)
ANOT(3.46분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

분석성분 (Compound)	정량한계(mg/kg)
	식육	유(乳)	알(卵)	어류
데코퀴네이트(Decoquinate)	0.1	0.004	0.004	0.004
디사이클라닐(Dicyclanil)	0.003	0.003	0.002	0.003
암프롤리움(Amprolium)	0.09	0.002	0.002	0.001
죠렌(Zoalene)	0.2	0.001	0.002	0.004
*3-Amino-5-nitro-o-toluamide	0.003	0.001	0.002	0.004

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.5 네오마이신(Neomycin)

가. 시험법 적용범위

벌꿀에 적용한다.

나. 분석원리

벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) MCX(Mixed Mode Cation Exchange) 카트리지 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g에 물 20 mL를 넣고 흔들어 섞어 충분히 녹이고 0.1 M 염산을 사용하여 pH 2로 조정한다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지(충진제 60 mg)에 흡착시키고 5 mL의 10% 메탄올성 수산화암모늄용액으로 용출하여 받는다. 용출액은 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 0.1 M 염산 1 mL로 녹인 후 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1×100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 20 mM 포름산(formic acid) 함유한 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 수용액

(2) 이동상 B: 20 mM 포름산(formic acid) 함유한 10 mM 노나플루오로펜탄산(nonafluoropentanoic acid) 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
0.5	30	70
5.0	5	95
5.1	50	50
10.0	50	50

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법：ESI(Positive ion mode)

나) Gas Temp.: 350℃

다) Gas Flow: 8 L/분(질소)

라) Nebulizer: 35 psi

마) Collision energy: 30 V

바) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	선구이온 (Precursor Ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)
네오마이신 (Neomycin)	614.6	615	455, 323, 163, 161

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 네오마이신의 함량을 구한다. 검량선 작성은 표준용액 2.5, 5.0, 10, 25, 50 μg/L의 5개 농도를 이용한다.

8.3.6 니트로빈(Nitrovin)

8.3.6.1 제1법

가. 시험법 적용범위

벌꿀에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 니트로빈을 디클로로메탄:메탄올:암모니아수 혼합용액으로 추출하고 메탄올과 초산과 부틸아민 혼합용액으로 녹인 후 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 2% 암모니아수 함유 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 이동상에 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 Ⓐ과정[디클로로메탄:메탄올:암모니아수(900:50:1, v/v/v) 혼합용액 20 mL를 넣은 후 흔들어 섞어 추출하고 30분간 흔들어 섞는다. 이를 2,500 ×g에서 10분간 원심분리하고 하층을 취한다.]을 실시한다. Ⓐ과정을 반복하여 하층을 합친 후 40℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물을 이동상 1 mL에 녹인다. 이를 다시 4,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 취하고 여기에 헥산 1 mL를 넣고 혼합한 후 4,000 ×g에서 5분간 원심분리하고 하층액을 취한다. 이를 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 분석조건

가) 컬럼: CN계 컬럼(4.6 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상: 메탄올:물:초산:부틸아민(2500:50:10:1, v/v/v/v)

다) 이동상 유량: 1.0 mL/분

라) 측정파장: 365 nm

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

3) 정량한계

니트로빈(Nitrovin): 0.05 mg/kg

사. 정성시험

액체크로마토그래프의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 스펙트럼으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 니트로빈의 함량을 구한다.

8.3.6.2 제2법

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

1) 축산물

시료 중 니트로빈을 1% 암모니아 함유 아세토니트릴으로 추출하고 아세토니트릴 포화 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

2) 수산물

시료 중 니트로빈을 물:아세토니트릴(20:80, v/v) 혼합용액으로 추출하고 아세토니트릴 포화 헥산과 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 1% 암모니아 함유 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 1% 암모니아 함유 아세토니트릴: 100 mL 용량플라스크에 수산화암모늄(28.2%) 3.55 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 1% DMSO(dimethyl sulfoxide) 함유 메탄올: 100 mL 용량플라스크에 DMSO 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

9) HLB 카트리지: HLB(200 mg) 고정상이 충전되어있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

10) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 축산물

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취한다. 1% 암모니아 함유 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 모두 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 하층액 중 5 mL를 취하여 40℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 물:아세토니트릴(30:70, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣어 녹이고, 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 수산물

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취한다. 물:아세토니트릴(20:80, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 모두 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 하층액 중 5 mL를 취하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고 메탄올:물(20:80, v/v) 혼합용액 5 mL로 유출시켜 버린 후, 1% DMSO 함유 메탄올 4 mL로 용출하여 받는다. 용출액을 취하여 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물에 물:아세토니트릴(30:70, v/v) 1 mL를 넣어 녹이고, 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ⨯ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
6.0	10	90
8.0	10	90
8.1	90	10
12.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 3.8 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트로빈 (Nitrovin)	3.6	360.2	360.1	361	180	20
					2221)	15
					302	19

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

니트로빈(3.6분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

니트로빈(Nitrovin): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.7 니트로푸란계 대사물질(AOZ, AMOZ, SEM, AHD)

가. 시험법 적용범위

축․수산물, 벌꿀 등에 적용한다. 다만, 갑각류의 경우 SEM 검출시에 8.3.51 니트로푸라존(Nitrofurazone) 시험법을 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 푸라졸리돈, 푸랄타돈, 니트로푸라존 및 니트로푸란토인의 대사물질을 염산용액으로 처리하여 니트로벤즈알데히드(NBA)로 유도체화한 후 에틸아세테이트로 추출하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다. 다만, 니트로푸라존의 대사물질인 세미카바자이드(SEM)의 경우, 조직과 결합되어 있는 SEM을 정량한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준물질: 3-amino-2-oxazolidinone(AOZ), 3-amino-5-morpholinomethyl-2-oxazolidinone (AMOZ), semicarbazide(SEM), 1-aminohydantoin(AHD)

4) 내부표준물질: 3-amino-2-oxazolidinone-d4(AOZ-d4), 3-amino-5-morpholinomethyl-2 –oxazolidinone-d5(AMOZ-d5)

5) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

6) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

7) 내부표준물질 원액: 100 mL 용량플라스크에 AOZ-d4, AMOZ-d5을 각각 정밀히 달아 메탄올에 녹여 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 내부 표준원액은 냉동 보관한다.

8) 내부표준물질 혼합용액: 100 mL 용량플라스크에 각 내부 표준원액을 메탄올로 희석하여 0.1 mg/L가 되게 한다.

9) 0.125 M 염산(HCl): 1000 mL 용량플라스크에 5 M 염산 25 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

10) 0.05 M 유도체화용액: 100 mL 갈색용량플라스크에 2-니트로벤즈알데히드(2-NBA, MW 151.12, 99%) 0.76 g을 넣고 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 표시선까지 채운다. 이 용액은 사용 직전에 만들어 사용한다.

11) 10 mM 유도체화용액: 100 mL 갈색용량플라스크에 2-니트로벤즈알데히드 0.152 g을 넣고 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 표시선까지 채운다. 이 용액은 사용 직전에 만들어 사용한다.

12) 1 M 인산칼륨 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 제이인산칼륨(K2HPO4) 175.6 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

13) 0.1 M 인산칼륨 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 제이인산칼륨(K2HPO4) 17.56 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

14) 1 M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨 39.99 g을 넣고 물로 녹인 후 표시선까지 채운다.

15) 10 mM 포름산암모늄 함유 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g, 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

16) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 벌꿀

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 ㉠{내부표준물질 혼합용액(0.1 mg/L) 100 μL를 넣고 15분간 정치하여 층을 분리시킨 후 0.125 M 염산 5 mL와 0.05 M 유도체화용액 200 μL를 넣고 37℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 반응시킨다. 유도체화한 시험용액을 실온까지 냉각시킨 후 1 M 인산칼륨용액 5 mL와 1 M 수산화나트륨용액 100 μL를 넣어 pH를 약 7.0으로 맞춘다. 이 용액에 헥산 4 mL를 넣고 흔들어 섞어 추출한 후 4,800 ×g에서 10분간 원심분리한다. 하층액을 새로운 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 4 mL를 넣고 혼합한 후, 4,800 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 취하여 유리관에 넣는다. 이런 과정을 2회 반복하여 얻어진 상층액을 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물을 50% 메탄올 0.5 mL에 녹인 후, 7,500 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 축·수산물

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. ★[메탄올 8 mL과 물 1 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞은 후, 4℃에서 3,400 ×g로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다. 다시 원심분리관에 메탄올 5 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞은 후 4℃에서 3,400 ×g로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다. 다시 원심분리관에 에탄올 5 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞은 후 4℃에서 3,400 ×g로 10분간 원심분리하고 상층액을 버린다.] 여기에 ㉡{내부표준물질 혼합용액 100 μL를 넣고 15분간 정치하여 층을 분리시킨 후 0.125 M 염산 10 mL와 10 mM 유도체화용액 200 μL를 넣고 37℃ 항온수조에서 흔들어 주면서 16시간 반응시킨다. 유도체화한 시험용액을 실온까지 냉각시킨 후 0.1 M 인산칼륨용액 10 mL(수산물의 경우 1 mL)와 1 M 수산화나트륨용액 1 mL를 넣어 pH를 약 7.4로 맞춘다. 이 시험용액의 잔류물을 제거하기 위해 4℃에서 4,500 ×g로 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 옮겨 헥산 10 mL를 넣고 혼합한 후 4℃에서 4,500 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 또 다른 새로운 원심분리관에 취하고 에틸아세테이트 7 mL를 넣고 혼합하고 4℃에서 4,500 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 이런 과정을 2회 반복하여 얻어진 상층액을 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물을 50% 메탄올 1 mL에 녹여 7,500 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

※ ★과정(메탄올과 에탄올 세척)은 세미카바자이드(SEM) 검출시 확인 및 정량시험시에만 적용한다.

바. 표준용액 유도체화

바탕시료(blank sample) 2 g을 50 mL 원심 분리관에 넣고 니트로푸란계 대사물질 혼합표준용액 10, 20, 40, 50, 100 및 200 μg/L를 각각 100 μL를 넣어 마.의 ㉠(벌꿀의 경우), ㉡(축·수산물의 경우)의 시험용액의 조제 과정을 각각 따른 후 표준용액으로 사용한다.

사. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액

(2) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
0.5	90	10
7.0	10	90
10.0	10	90
10.1	90	10
13.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.4 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 3.8 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

1) 정량이온

연번	분석성분 (Compound)	분석물질 (Analyzed compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	푸라졸리돈 (Furazolidone, AOZ)	2-NP-AOZ	4.6	235.2	235.1	236.1	78	20
							104	20
							1341)	10
2	푸랄타돈 (Furaltadone, AMOZ)	2-NP-AMOZ	3.6	334.3	334.1	335.1	128	20
							262	15
							2911)	10
3	니트로푸라존 (Nitrofurazone, SEM)	2-NP-SEM	4.6	208.2	208.1	209.1	134	9
							1661)	9
							192	9
4	니트로푸란토인 (Nitrofurantoine, AHD)	2-NP-AHD	4.4	248.2	248.1	249.1	104	20
							1341)	10
							178	15
5	푸라졸리돈-d4 (내부표준물질) (AOZ-d4,IS)	2-NP-AOZ-d4	4.4	239.2	239.1	240.1	1341)	15
6	푸랄타돈-d4 (내부표준물질) (AMOZ-d5,IS)	2-NP-AMOZ-d5	3.5	339.4	339.2	340.2	2961)	10

마) 분석대상물질 조건

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

Furazolidone(2-NP-AOZ)(4.6분)

Furaltadone(2-NP-AMOZ)(3.6분)

Nitrofurazon(2-NP-SEM)(4.6분)

Nitrofurantoine(2-NP-AHD)(4.4분)

Furazolidone-d4(2-NP-AOZ-d4)(4.4분)

Furaltadone-d5(2-NP-AMOZ-d5)(3.5분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

니트로푸란계 대사물질(AOZ, AMOZ, SEM, AHD): 0.001 mg/kg(벌꿀)

니트로푸란계 대사물질(AOZ, AMOZ, SEM, AHD): 0.0005 mg/kg(축·수산물)

*단, 수산물 중 AHD의 경우는 0.001 mg/kg

아. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

자. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

※ 갑각류의 경우 대사물질 SEM 확인으로 니트로푸라존 정성시험이 가능하나, SEM 검출이 확인될 경우 8.3.51 니트로푸라존(Nitrofurazone) 시험법으로 확인․정량 시험한다.

8.3.8 델타메트린(Deltamethrin)

가. 시험법 적용범위

축․수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료를 헥산으로 흔들어 섞어 추출하고 아세토니트릴로 추출하여 감압(또는 질소)농축한 후 기체크로마토그래프-전자포획검출기(electron capture detector)로 분석한다.

다. 장치

기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세톤에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 헥산으로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 흔들어 섞고 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞어 추출하고 5분간 흔들어 섞은 뒤 1,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 하층을 취하여 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 알(卵)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 디클로로메탄:헥산(1:1, v/v) 혼합용액 20 mL를 넣은 다음 2분간 흔들어 섞어 추출하고 20분간 흔들어 섞어준 뒤 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 10 g을 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한 후 -20℃에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 상층 10 mL를 취하여 분액깔때기에 옮긴다. 포화염화나트륨 수용액 20 mL, 물 50 mL 및 디클로로메탄 50 mL를 넣고 흔들어 섞어준 뒤 정치하여 층을 분리시킨 후, 하층에 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

3) 가금류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 초산 함유 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 흔들어 섞어 추출하고 30분간 흔들어 섞은 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한 후 -20℃에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 상층 10 mL를 취하여 분액깔때기에 옮긴다. 포화염화나트륨 수용액 15 mL, 물 35 mL 및 디클로로메탄 20 mL를 넣고 흔들어 섞은 뒤 정치하여 층을 분리시킨 후, 하층에 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 취한다. 다시 디클로로메탄 20 mL를 넣어 위 과정을 1회 반복하고 모아진 추출물은 40℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

4) 어류

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 2% 초산 함유 아세토니트릴 20 mL와 염화나트륨 4 g을 넣은 다음 2분간 흔들어 섞어 추출하고 30분간 흔들어 섞은 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 무수황산나트륨 5 g을 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한 후 -20℃에서 30분간 정치하여 지질을 응고시키고 상층 10 mL를 취하여 250 mL 분액깔때기에 옮긴다. 포화염화나트륨 수용액 15 mL, 물 35 mL 및 디클로로메탄 30 mL를 넣고 흔들어 섞은 뒤 정치하여 층을 분리시킨 후, 하층에 무수황산나트륨을 통과시켜 수분을 제거하면서 취한 후 40℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축한다. 잔류물은 에틸아세테이트 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

5) 유(乳), 알(卵), 가금류, 어류 외 식품

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 2분간 흔들어 섞어 추출하고 30분간 흔들어 섞은 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞어 추출하고 5분간 흔들어 섞은 후 -20℃에서 30분간 정치하여 층을 분리시킨다. 하층을 취하고 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: Ultra-2 캐필러리 컬럼(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 이동상 유량: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것, 1 mL/분

다) 오븐 온도: 180℃에서 시료를 주입하고 10℃/분의 비율로 240℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다. 다시 5℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시켜 5분간 유지한다.

라) 주입부 온도: 270℃

마) 주입부: Split mode(5:1)

바) 주입량: 2 μL

사) 검출기온도: 300℃

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프-전자포획검출기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성시험

기체크로마토그래프-전자포획검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 델타메트린 함량을 구한다.

8.3.9 도라멕틴(Doramectin), 아바멕틴(Abamectin), 에프리노멕틴(Eprinomectin), 이버멕틴(Ivermectin)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨이 포함된 아세토니트릴:물(5:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 황산마그네슘과 C18 분말, PSA(Primary Secondary Amine)로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 20 mM 포름산 암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 암모늄 1.26 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 소고기, 가금류 고기, 알(卵)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 물 2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 혼합한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 4℃에서 4,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 황산마그네슘 150 mg와 C18 50 mg을 미리 넣어 둔 15 mL 원심분리관에 상층액 1 mL를 합한 후 5분간 흔들어 섞고 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 이 용액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 돼지고기

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 물 2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 혼합한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 4℃에서 4,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 황산마그네슘 150 mg와 PSA 50 mg을 미리 넣어 둔 15 mL 원심분리관에 상층액 1 mL를 합한 후 5분간 흔들어 섞고 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 이 용액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

3) 유(乳)

균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 물 2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 혼합한다. 여기에 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 4℃에서 4,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 황산마그네슘 150 mg, PSA 50 mg, C18 50 mg을 미리 넣어 둔 15 mL 원심분리관에 상층액 1 mL를 합한 후 5분간 흔들어 섞고 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 이 용액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 20 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	70	30
1.0	70	30
2.5	5	95
8.0	5	95

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 3.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	도라멕틴 (Doramectin)	5.4	899.1	898.5	916.5	219.2	26
						331.21)	26
						593.3	14
2	아바멕틴 B1a (Abamectin B1a)	5.1	873.1	872.5	890.5	305.21)	22
						567.3	10
						711.4	8
3	에프리노멕틴 B1a (Eprinomectin B1a)	4.7	914.1	913.5	914.6	154.1	20
						186.11)	16
						330.2	10
4	이버멕틴 B1a (Ivermectin B1a)	6.2	875.1	874.5	892.5	307.2	24
						569.31)	12
						713.5	10
1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

가) 도라멕틴(5.4분)

소고기	돼지고기
닭고기	알(卵)
유(乳)

나) 아바멕틴 B1a

소고기	돼지고기
닭고기	알(卵)
유(乳)

(5.1분)

다) 에프리노멕틴 B1a

소고기	돼지고기
닭고기	알(卵)
유(乳)

(4.7분)

라) 이버멕틴 B1a

소고기	돼지고기
닭고기	알(卵)
유(乳)

(6.1분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

도라멕틴(Doramectin): 0.005 mg/kg

아바멕틴 B1a(Abamectin B1a): 0.005 mg/kg

에프리노멕틴 B1a(Eprinomectin B1a): 0.005 mg/kg

이버멕틴 B1a(Ivermectin B1a): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.10 노르제스토메트(Norgestomet), 디에네스트롤(Dienestrol), 디에틸스틸베스트롤(Diethylstilbestrol), 메드록시프로게스테론 아세테이트(Medroxyprogesterone acetate), 에스트라디올(Estradiol-17β), 제라놀(Zeranol), 초산멜렌게스트롤(Melengestrol acetate), 초산트렌볼론(Trenbolone acetate), 테스토스테론(Testosterone), 프로게스테론(Progesterone), 헥스트롤(Hexestrol)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다. 단, 프로게스테론(Progesterone)의 경우 유(乳) 및 알(卵)은 제외한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 헥산 또는 PSA(Primary Secondary Amine)로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨(sodium acetate) 0.82 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산을 이용하여 pH를 4.6으로 맞추고 사용한다.

6) 1% 아세트산(acetic acid) 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액: 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.

7) 0.1 mM 불화암모늄(ammonium fluoride) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 2 mL를 넣고 2분간 초음파 처리하여 흔들어 섞어 추출한다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/arylsulfatase) 20 μL를 넣고 65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 12 mL를 넣고 10분간 초음파 처리 후 15분간 흔들어 섞고 4℃에서 9,300 ×g로 10분간 원심분리한다. (㉠돼지고기를 제외한 축·수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 헥산 12 mL를 넣고 2분간 흔들어 섞어준다. 4℃에서 9,300 ×g로 5분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 감압(또는 질소)농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간 흔들어 섞는다. 4℃에서 9,300 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압(또는 질소)농축한다.) 잔류물에 50% 메탄올 1 mL를 넣어 녹이고 상온에서 15,800 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1 mM 불화암모늄(ammonium fluoride) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.00	50	50
4.00	0	100
7.00	0	100
7.01	50	50
10.00	50	50

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	노르제스토메트 (Norgestomet)	3.91	Positive	372.5	372.2	373.0	313.31)	13
							271.2	17
							109.2	33
2	디에네스트롤 (Dienestrol)	3.69	Negative	266.3	266.1	264.9	92.81)	26
							248.9	27
							220.9	26
3	디에틸스틸베스트롤 (Diethylstilbestrol)	3.67	Negative	268.3	268.1	266.9	236.91)	29
							250.9	25
							221.9	35
4	메드록시프로게스테론 아세테이트 (Medroxyprogesterone acetate)	4.19	Positive	386.5	386.3	387.0	327.41)	16
							123.1	29
5	에스트라디올 (Estradiol-17β)	3.67	Negative	272.4	272.2	271.0	144.91)	41
							182.9	41
							143.1	54
6	제라놀 (Zeranol)	3.57	Negative	322.4	322.2	320.9	277.11)	23
							303.0	22
							258.9	26
7	초산멜렌게스트롤 (Melengestrol acetate)	4.26	Positive	396.5	396.2	397.1	279.31)	21
							337.4	16
							221.3	41
8	β-트렌볼론 (β-Trenbolone)	3.38	Positive	270.4	270.2	271.0	199.21)	22
							253.3	21
							165.1	52
9	테스토스테론 (Testosterone)	3.73	Positive	288.4	288.2	289.0	97.11)	25
							109.2	27
							79	49
10	프로게스테론 (Progesterone)	4.28	Positive	314.5	314.2	315.0	96.91)	26
							109.2	23
							297.3	16
11	헥스트롤 (Hexestrol)	3.76	Negative	270.4	270.2	268.9	118.81)	38
							133.9	16
							132.9	16

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

노르제스토메트(3.91분)	디에네스트롤(3.69분)
디에틸스틸베스트롤(3.67분)	메드록시프로게스테론 아세테이트(4.19분)
에스트라디올(3.67분)	제라놀(3.57분)
초산멜렌게스트롤(4.26분)	β-트렌볼론(3.38분)
테스토스테론(3.73분)	프로게스테론(4.28분)
헥스트롤(3.76분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

분석성분 (Compound)	정량한계 (mg/kg)
	식육	유(乳)	알(卵)	수산물
노르제스토메트(Norgestomet)	0.002 (소: 0.00003)	0.00006	0.0008	0.003
디에네스트롤(Dienestrol)	0.003	0.004	0.003	0.003
디에틸스틸베스트롤 (Diethylstilbestrol)	0.0005	0.0004	0.0002	0.0004
메드록시프로게스테론 아세테이트 (Medroxyprogesterone acetate)	0.002	0.003	0.0008	0.002
에스트라디올(Estradiol-17β)	0.004	0.005	0.004	0.003
제라놀(Zeranol)	0.001 (소: 0.0005)	0.004	0.001	0.001
초산멜렌게스트롤 (Melengestrol acetate)	0.001 (소: 0.0003)	0.002	0.0005	0.003
β-트렌볼론(β-Trenbolone)	0.004 (소: 0.0002)	0.004	0.003	0.002
테스토스테론(Testosterone)	0.002	0.002	0.001	0.002
프로게스테론(Progesterone)	0.004	-	-	0.002
헥스트롤(Hexestrol)	0.003	0.005	0.002	0.003

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.11 아빌라마이신(Avilamycin)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출 후 C18으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

5) 0.1 M Na2-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate): 500 mL 용량플라스크에 Na2-EDTA 18.62 g를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) C18 분말: 잔여 실란올기가 제거된 C18 분말(55∼105 μm, 125 Å) 또는 이와 동등한 것

7) 기타 시약: 특급 또는 이와 동등한 것

8) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. (단, 알 및 수산물의 경우 0.1 M Na2-EDTA 1 mL를 넣고 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 9 mL를 넣는다.) 4,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액 모두 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. C18 분말 500 mg과 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 분말을 제외한 하층액 중 5 mL를 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣고 녹인 후, 4,800 ×g, 4℃에서 3분간 원심분리하고 얻은 상층액을 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
1.0	80	20
5.0	20	80
6.0	0	100
10.0	0	100
10.2	80	20
15.0	80	20

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
아빌라마이신 (Avilamycin)	5.54	1404.2	1402.5	1424.9	917.21)	55
					791.1	55

마) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아빌라마이신(5.54분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

아빌라마이신(Avilamycin): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.12 겐티안 바이올렛(Gentian violet), 말라카이트 그린(Malachite green), 메틸렌 블루(Methylene blue) 동시시험법

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 1% 초산으로 처리 후 1% 초산 함유 아세토니트릴로 추출하고 무수황산나트륨(Na2SO4)과 C18, PSA(Primary Secondary Amine)으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올(류코겐티안 바이올렛은 5% DMSO(dimethyl suloxide) 함유 메탄올)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 50% 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 1% 초산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 초산 10 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 1% 초산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량 플라스크에 초산 10 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 10 mM 초산암모늄 함유 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 초산암모늄 0.7708 g과 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 1% 초산 수용액 1 mL를 넣은 후 강하게 흔들어 섞는다. 1% 초산 함유 아세토니트릴 10 mL를 넣고 무수황산나트륨 2 g을 넣어 5분간 흔들어 섞은 뒤 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 C18 100 mg, PSA 100 mg이 담겨진 원심분리관에 취한 후 5분간 흔들어 섞는다. 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한 뒤, 상층액 중 1 mL를 취하여 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 유리바이알에 담아 시험용액으로 사용한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mmｘ 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 함유한 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
1.0	95	5
5.0	10	90
8.0	10	90
8.1	95	5
12.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	겐티안 바이올렛 (Gentian violet)	6.1	408.0	407.2	372.1	235.1	55
						340.2	55
						356.21)	39
	류코겐티안 바이올렛 (Leucogentian violet)	7.9	373.5	373.3	374.1	238.2	28
						239.2	35
						358.31)	32
2	말라카이트 그린 (Malachite green)	5.5	364.9	364.1	329.1	165.2	55
						208.2	34
						313.21)	36
	류코말라카이트 그린 (Leucomalachite green)	7.9	330.5	330.2	331.0	223.1	55
						239.21)	31
						316.2	21
3	메틸렌 블루 (Methylene blue)	4.6	319..9	319.1	284.0	240.1	33
						252.1	52
						268.11)	34
	아주르 B (Azure B)	4.4	305.8	305.1	269.9	212.1	52
						228.1	34
						254.11)	33

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아주르 B(4.4분), 메틸렌 블루(4.6분), 말라카이트 그린(5.6분), 겐티안 바이올렛(6.1분),

류코말라카이트 그린(7.9분), 류코겐티안 바이올렛(7.9분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

겐티안 바이올렛(Gentian violet): 0.002 mg/kg

류코겐티안 바이올렛(Leucogentian violet): 0.002 mg/kg

말라카이트 그린(Malachite green): 0.002 mg/kg

류코말라카이트 그린(Leucogentian violet): 0.002 mg/kg

메틸렌 블루(Methylene blue): 0.002 mg/kg

아주르 B(Azure B): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.13 목시덱틴(Moxidectin)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 목시덱틴을 아세토니트릴로 추출하고 추출액을 C18 카트리지로 정제한 후 메틸이미다졸(N-methylimidazole)과 무수트리플루오르초산으로 유도체화한다. 유도체화한 시험용액을 액체크로마토그래프-형광검출기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올에 녹인 후 각 시험관에 2 mL 취한다. 각각의 시험관은 질소농축하고 마.시험용액 조제의 방법과 같이 유도체화하여 표준용액으로 사용한다.

5) 0.1% 트리에틸아민 함유 30% 아세토니트릴: 트리에틸아민 0.1 mL와 아세토니트릴 30 mL를 물에 녹여 100 mL가 되게 한다.

6) C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 추출·정제

균질화한 시료 1 g을 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 7 mL를 넣는다. 시험관을 10분간 흔들어 섞은 후 10분간 초음파처리하고 3,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액은 원심분리관에 옮기고 잔류물에 아세토니트릴 5 mL를 넣고 위의 과정을 반복한다. 상층액을 위의 용액과 합한 후 물 10 mL를 넣고 이를 추출액으로 한다. 미리 아세토니트릴 5 mL와 0.1% 트리에틸아민 함유 30% 아세토니트릴 5 mL를 순차적으로 넣어 활성화한 C18 카트리지에 추출액을 흡착시킨다. 0.1% 트리에틸아민 함유 30% 아세토니트릴 1 mL와 70% 아세토니트릴 1 mL로 유출시켜 버리고 감압조건에서 약 1분간 건조시킨다. 카트리지에 90% 아세토니트릴 3 mL를 넣어 대상 성분을 용출하여 받은 뒤 40℃ 이하에서 질소농축한다.

2) 유도체화

추출․정제액과 표준용액에 메틸이미다졸(N-methylimidazole):아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합액 100 μL와 무수트리플루오로초산(anhydrous trifluoroacetate):아세토니트릴(1:2, v/v) 혼합액 150 μL를 넣어 녹이고 충분히 혼합한 후 시험용액으로 사용한다. 이들 용액은 시험 당일 조제하며, 시험용액은 액체크로마토그래프에 주입 전까지 차광되게 하고 유도체화 후 6시간 이내에 분석한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(4.0 mm × 125 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상: 94% 아세토니트릴

다) 이동상 유량: 2 mL/분

라) 측정파장: 여기파장 361 nm, 형광파장 465 nm

마) 컬럼 온도: 40℃

바) 주입량: 10 μL

2) 검량선 작성
유도체화한 표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적을 구하여 검량선을 작성한다.

3) 표준품 크로마토그램

목시덱틴(3.0분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

4) 정량한계

축산물, 유: 0.005 mg/kg

사. 정성시험

액체크로마토그래프-형광검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름시간으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 목시덱틴 함량을 구한다.

8.3.14 반코마이신(Vancomycin)

가. 시험법 적용범위
축․수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 50 mM 암모늄아세테이트 함유 15% 아세토니트릴로 추출(유(乳)의 경우 10 mM 암모늄아세테이트 함유 80% 아세토니트릴)하고, SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 표준원액으로 사용한다.

4) 표준용액: 표준원액을 물로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

5) MCX(Mixed mode Cation Exchange) 카트리지(150mg, 6cc) 또는 이와 동등한 것

6) 50 mM 암모늄아세테이트 함유 15% 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 암모늄아세테이트 3.85 g을 넣고 15% 아세토니트릴 용액을 표시선까지 채운다.

7) 10 mM 암모늄아세테이트 함유 80% 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 암모늄아세테이트 0.77 g을 넣고 80% 아세토니트릴 용액을 표시선까지 채운다.

8) 메탄올:수산화암모늄(97:3, v/v): 100 mL 용량플라스크에 수산화암모늄 3 mL를 넣고 메탄올을 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

10) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 50 mM 암모늄아세테이트 함유 15% 아세토니트릴 10 mL(유(乳)의 경우, 10 mM 암모늄 아세테이트 함유 80% 아세토니트릴 10 mL)를 넣고 10분간 흔들어 섞어 추출한 후 -4℃, 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관에 옮긴다. 남은 잔류물에 50 mM 암모늄아세테이트 함유 15% 아세토니트릴 5 mL(유(乳)의 경우, 10 mM 암모늄 아세테이트 함유 80% 아세토니트릴 5 mL)를 넣고 위의 과정을 반복한 후 상층액을 합한다. 이 상층액에 물 포화 헥산 6 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 –4℃, 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 나온 하층액을 추출액으로 한다. 미리 메탄올 3 mL, 물 3 mL, 0.1% 포름산을 포함한 물 3 mL로 활성화시킨 MCX 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 6 mL로 유출시켜 버린 후 메탄올:수산화암모늄(97:3, v/v) 6 mL로 용출하여 받는다. 이 용출액을 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물에 0.1% 포름산을 포함한 10% 아세토니트릴 1 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 150 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	98	2
0.5	98	2
8.0	70	30
8.5	2	98
10.0	2	98
10.1	98	2
13.0	98	2

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
반코마이신 (Vancomycin)	4.97	1449.2	1447.4	725.2	144.11)	15.0
					100.1	40.0
					82.9	25.0
1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

반코마이신(4.97분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

반코마이신(Vancomycin): 0.001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.15 밤버마이신(Bambermycin, Flavomycin, Flavophospholipol)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 밤버마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 이동상으로 희석하여 사용한다.

5) 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2): 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 물로 녹여 표시선까지 채운다.

6) C18 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g에 아세토니트릴 6 mL를 넣어 완전히 혼합한 후 1,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치한 후 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃ 이하에서 질소 농축한 후 잔류물을 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 3 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL 및 2% 아세톤 함유 헥산 5 mL로 3회 유출시켜 버린 후, 메탄올 6 mL로 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 50 mm, 1.9 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 5% 아세토니트릴

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	50	50
20.0	90	10
20.1	50	50
25.0	50	50

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Spray voltage: 4.5 kV

다) Capillary temperature: 280℃

라) Sheath gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것(50 psi)

마) Auxiliary gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것(10 psi)

바) SIM ion: m/z 1580

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성 및 확인시험
액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간(retention time)을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 밤버마이신의 함량을 구한다.

8.3.16 세파세트릴(Cefacetrile), 세파피린(Cephapirin), 세팔로니움(Cefalonium), 세푸록심(Cefuroxime), 세프퀴놈(Cefquinome), 세프티오퍼(Ceftiofur)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 1% 인산완충용액 및 아세토니트릴(닭 시료의 경우 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액)로 추출하고 C18과 황산마그네슘(MgSO4)으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각각의 표준품을 아래 용매에 녹여 100 μg/mL가 되도록 한다.

용매	대상 동물용의약품
25% 아세토니트릴	세파피린, 세푸록심
50% 아세토니트릴	세팔로니움, 세프티오퍼*, 데스후로일 세프티오퍼
DMSO	데스아세틸세파피린, 세파세트릴, 세프퀴놈
* 세프티오퍼가 용매에 충분히 녹지 않을 경우, 산(HCl)을 첨가하여 희석

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 1% 인산완충용액: 1,000 mL 용량플라스크에 제일인산칼륨(KH2PO4) 8.0 g과 제이인산칼륨(K2HPO4) 2.0 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 물로 채운다.

8) C18 분말: 잔여 실란올기가 제거된 C18 분말(55∼105 μm, 125 Å) 또는 이와 동등한 것

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

10) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 1% 인산완충용액 3 mL와 아세토니트릴 7 mL를 넣고(닭 시료의 경우, 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고) 10분간 흔들어 섞는다. 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액 모두를 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. C18 분말 150 mg과 MgSO4 900 mg을 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액 중 5 mL를 취하여 새로운 15 mL 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 1 mL 이하로 질소 농축한다(약 0.5 mL 남김). 잔류물에 물을 넣고 1 mL로 맞춘 후, 4,800 ×g, 4 ℃에서 3분간 원심분리하고 얻은 상층액을 0.2 μm Nylon 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 150 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	98	2
4.5	40	60
5.5	5	95
8.0	5	95
8.1	98	2
12.0	98	2

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 3.6 kV(Positive), -2.8 kV(Negative)

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact Mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision Energy, eV)
1	세파세트릴 (Cefacetrile)	3.84	Positive	339.1	339.0	357.0	280.11)	10
							156.1	14
							251.9	15
2	세파피린 (Cephapirin)	3.25	Positive	423.1	423.0	423.9	292.01)	16
							152.0	24
							124.1	46
	데스아세틸 세파피린 (Desacetyl cephapirin)	2.76	Positive	381.1	381.0	381.9	152.01)	14
							112.1	26
							220.0	25
3	세팔로니움 (Cefalonium)	3.68	Positive	458.1	458.0	458.9	337.01)	11
							152.0	21
							123.1	12
4	세푸록심 (Cefuroxime)	4.28	Negative	424.1	424.0	422.9	207.01)	14
							318.0	9
							362.0	9
5	세프퀴놈 (Cefquinome)	3.41	Positive	528.1	528.1	529.0	134.11)	15
							395.9	14
							125.0	55
6	세프티오퍼 (Ceftiofur)	4.72	Positive	523.6	523.0	523.9	241.01)	17
							125.0	52
	데스후로일 세프티오퍼 (Desfuroyl ceftiofur)	4.10	Positive	429.5	429.1	429.9	125.21)	16
							258.8	31
							284.7	50

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

세파세트릴(3.84분)	세파피린(3.25분)	데스아세틸세파피린 (2.76분)	세팔로니움(3.68분)
세푸록심(4.28분)	세프퀴놈(3.41분)	세프티오퍼(4.72분)	데스후로일 세프티오퍼 (4.10분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

분석성분 (Compound)	정량한계
	식육	알(卵)	유(乳)	어류	갑각류
세파세트릴 (Cefacetrile)	0.001	0.005	0.005	0.005	0.001
세파피린 (Cephapirin)	0.005	0.005	0.005	0.001	0.001
데스아세틸세파피린 (Desacetylcephapirin)	0.005	0.005	0.005	0.001	0.001
세팔로니움 (Cefalonium)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.001
세푸록심 (Cefuroxime)	0.005	0.005	0.005	0.001	0.001
세프퀴놈 (Cefquinome)	0.005	0.005	0.005	0.001	0.005
세프티오퍼 (Ceftiofur)	0.005	0.005	0.005	0.005	0.005
데스후로일 세프티오퍼 (Desfuroyl ceftiofur)	0.005	0.005	0.01	0.005	0.005

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기 상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램 상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.17 디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin)

가. 시험법 적용범위
벌꿀 등에 적용한다.

나. 분석원리
벌꿀에 물을 넣어 균질화한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제한 후 유도체화 장치가 장착된 액체크로마토그래프-형광검출기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 이동상으로 희석하여 사용한다.

5) Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone Copolymer(충진제) 카트리지 컬럼：HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것

6) 0.2 M 헵탄설폰산나트륨용액：헵탄설폰산나트륨(HSA, sodium heptane-1-sulfonic acid) 2.0225 g을 물 50 mL에 녹인다.

7) 0.01 M 헵탄설폰산나트륨용액: 헵탄설폰산나트륨 2.0225 g을 물 1 L에 녹인다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 20 mL에 녹여 15분간 흔들어 섞어 추출한 후 0.2 M 헵탄설폰산나트륨용액 1 mL를 넣는다. 미리 메탄올 5 mL, 물 5 mL로 유출시켜 버린 후 활성화시킨 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지(충진제 60 mg)에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 유출시켜 버린 후 메탄올 5 mL로 용출하여 받는다. 용출액은 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 0.01 M 헵탄설폰산나트륨용액(초산으로 pH 3.3으로 조정) 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터(membrane filter)로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(3.0×250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상：0.01 M 헵탄설폰산나트륨용액 수용액 800 mL에 1,2-나프토퀴논-4-설폰산 (1,2-naphthoquinone-4-sulfonic acid) 0.10408 g을 녹인 용액과 아세토니트릴 200 mL를 혼합하고 초산을 이용하여 pH를 3.5로 맞춘 후 갈색 유리병에 보관한다.

다) 이동상 유량: 0.8 mL/분

라) 측정파장: 여기파장 260 nm, 형광파장 435 nm

마) 컬럼후 유도체화 장치

(1) 이동상: 0.2 M 수산화나트륨(sodium hydroxide) 용액

(2) 이동상 유량: 0.5 mL/분

(3) 반응코일: 10 m

(4) 반응온도: 55℃

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-형광검출기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

3) 정량한계

디히드로스트렙토마이신(Dihydrostreptomycin), 스트렙토마이신(Streptomycin): 0.1 mg/kg

사. 정성시험

액체크로마토그래프-형광검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름시간으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 디히드로스트렙토마이신 및 스트렙토마이신 함량을 각각 구한다.

8.3.18 사이퍼메트린(Cypermethrin), 사이플루트린(Cyfluthrin), 사이할로트린(Cyhalothrin)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다(단, 사이퍼메트린은 알(卵)에 한함).

나. 분석원리

시료를 헥산으로 흔들어 섞어 추출하고 아세토니트릴로 추출하여 감압(또는 질소)농축한 후 기체크로마토그래프-전자포획검출기(electron capture detector)로 분석한다.

다. 장치

기체크로마토그래프-전자포획검출기(GC-ECD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 아세톤에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 헥산으로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳)
균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣은 다음 20분간 흔들어 섞은 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞어 추출하고 5분간 흔들어 섞은 후 1,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 하층을 취하여 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 유(乳)외 식품
균질화한 시료 10 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣은 다음 2분간 흔들어 섞어 추출하고 30분간 흔들어 섞은 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 새로운 50 mL 원심분리관에 취한다. 여기에 아세토니트릴 20 mL를 넣어 2분간 흔들어 섞어 추출하고 5분간 흔들어 섞은 후 -20℃에서 30분간 정치하여 층을 분리시킨다. 하층을 취하여 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 헥산 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 분석조건

가) 컬럼: Ultra-2 캐필러리 컬럼(30 m × 0.25 mm I.D., 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 이동상 유량: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것, 1 mL/분

다) 오븐 온도: 100℃에서 시료를 주입하고 2분간 유지 후 10℃/분의 비율로 200℃까지 온도를 상승시킨다. 다시 5℃/분의 비율로 220℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지하고 계속하여 5℃/분의 비율로 300℃까지 온도를 상승시켜 2분간 유지한다.

라) 주입부 온도: 250℃

마) 주입부: Split mode(10:1)

바) 검출기 온도: 320℃

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프-전자포획검출기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성시험

기체크로마토그래프-전자포획검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 사이퍼메트린, 사이플루트린 및 사이할로트린의 함량을 구한다.

8.3.19 폭심(Phoxim)

가. 시험법 적용범위

축산물에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 폭심을 아세토니트릴 추출하고 SPE 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1 L 용량 플라스크에 일정량의 물을 넣고 포름산 1 mL 넣은 후, 최종 표시선까지 물로 채운다.

6) Silica 카트리지(6 mL, 500 mg) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 20 mL를 넣어 200 ×g로 20분간 흔들어 섞어 추출한다. 원심분리기로 7℃에서 5,000 ×g로 5분간 원심분리 후 상층액을 취한 다음, 다시 아세토니트릴 20 mL를 넣어 다시 추출한다. 모은 상층액 40 mL를 감압(또는 질소)농축하고 잔류물을 n-헥산 5 mL로 2번 녹인 뒤, 미리 n-헥산 10 mL로 활성화한 실리카 카트리지(6 mL, 500 mg)에 넣는다. 이어서 카트리지에 디클로로메탄 20 mL로 용출하여 받은 뒤 40℃ 이하에서 질소 농축한 후 잔류물을 아세토니트릴 500 μL로 녹인다. 이 시료 용액을 멤브레인필터로 여과한 후 2 mL 갈색 바이알(Vial)에 옮겨 분석 전까지 –4℃ 이하의 냉장고에 보관하고, 이를 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ⨯ 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	60	40
2.0	10	90
10.0	10	90
10.1	60	40
20.0	60	40

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 25℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision energy: 3 eV

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision energy)
폭심 (Phoxim)	6.0	298.3	298.1	299	1291) 77 97	3

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

폭심(6.0분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

폭심(Phoxim): 0.025 mg/kg(식육)

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.20 시미아졸(Cymiazole), 아미트라즈(Amitraz), 쿠마포스(Coumaphos), 플루발리네이트(Fluvalinate)

가. 시험법 적용범위
벌꿀 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 물과 아세토니트릴로 추출한 후 원심분리하여 상층액을 취해 PSA(Primary Secondary Amine), C18 및 황산나트륨을 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1 L 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.2 M 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 수용액: 1 L 용량플라스크에 인산수소이나트륨 28.4 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 0.2 M 인산수소이나트륨 수용액 5 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞는다. 아세토니트릴 12 mL과 MgSO4 6 g, NaCl 1.5 g을 넣고 10분간 흔들어 섞은 뒤 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. PSA 150 mg, C18 150 mg, MgSO4 900 mg이 담긴 50 mL 원심분리관에 상층액 15 mL를 넣e고 10분간 흔들어 섞고 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 전량 취하여 45℃ 이하에서 질소 농축한 후 아세토니트릴 1 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 후 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	20	80
10	20	80

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 3.8 kV

라) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	시미아졸 (Cymiazole)	1.31	218.3	218.1	219	144	39
						1711)	33
						105	37
2	아미트라즈 (Amitraz)	4.32	293.4	293.2	294	1631)	17
						122	37
						107	55
3	2,4-디메틸아닐린* (2,4-Dimethylaniline)	1.73	121.1	121.1	122	1071)	21
						77	35
4	쿠마포스 (Coumaphos)	2.77	362.8	362.0	363	105	21
						2271)	27
						307	21
5	플루발리네이트 (Fluvalinate)	6.99	502.9	502.1	503	211	35
						2081)	19
						181	37

1) 정량이온

* 2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline): 아미트라즈(Amitraz)의 대사산물임

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

시미아졸(1.31분)

아미트라즈(4.32분)

2,4-디메틸아닐린(1.73분)

쿠마포스(2.77분)

플루발리네이트(6.99분)

5) 정량한계

시미아졸(Cymiazole): 0.003 mg/kg

아미트라즈(Amitraz): 0.001 mg/kg

2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline): 0.005 mg/kg

쿠마포스(Coumaphos): 0.003 mg/kg

플루발리네이트(Fluvalinate): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.21 트리클라벤다졸(Triclabendazole)

가. 시험법 적용범위
수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출한 후 분산고체상 추출법(dispersive solid phase extraction)으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품(주1) 참조)을 디메틸설폭사이드(DMSO)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 내부표준물질 표준원액: 옥시벤다졸-D7 표준품을 100 mL 용량플라스크에 정밀히 달아 DMSO로 표시선까지 채워 100 mg/L가 되게 한다. 조제된 내부표준물질 표준원액은 냉동 보관한다.

6) 내부표준물질 용액: 내부표준물질 표준원액을 메탄올로 희석하여 1 mg/L가 되게 한다.

7) 맥바인(Mcllvaine) 완충용액(pH 2): 0.1 M 구연산(citric acid, anhydrous) 수용액 500 mL에 0.2 M 인산나트륨(disodium hydrogen phosphate) 용액 45 mL를 넣어 pH를 2로 맞춘다.

8) 산화방지용액: 250 mL 용량플라스크에 EDTA․4Na(tetra sodium-ethylene diamine tetraacetate) 0.07 g, 아스코르빈산 9 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

9) 20 mM 포름산암모늄 용액: 1 L 용량플라스크에 포름산암모늄(ammonium formate) 1.26 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

10) 0.1% 포름산 수용액: 100 mL 용량플라스크에 포름산(formic acid) 0.1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

11) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

주1) 트리클라벤다졸의 대사산물

검사항목	분석대상물질
트리클라벤다졸 (Triclabendazole)	트리클라벤다졸(Triclabendazole), 케토트리클라벤다졸(Keto-triclabendazole)

마. 시험용액 조제

1) 연어 및 장어 이외 어류

균질화한 시료 4 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 산화방지용액 1 mL와 황산암모늄 2 g을 넣고 10분간 흔들어 섞은 뒤, 내부표준물질 용액 400 μL를 넣고 60분간 평형화(equilbration)시킨다. 염화나트륨 0.3 g과 맥바인 완충용액 2 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. ⓐ아세토니트릴 5 mL를 넣어 15분간 강하게 흔들어 섞고 4℃에서 5,600 ×g로 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를 넣는다. ⓑ잔류물에 아세토니트릴 5 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞고 4℃에서 5,600 ×g로 20분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를 넣는다. ⓐ와 ⓑ의 상층액을 합한 후 MgSO4 900 mg과 PSA (Primary Secondary Amine) 150 mg이 담긴 15 mL 원심분리관에 옮겨 10분간 흔들어 섞어 추출한 후 상온에서 5,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 상층액을 10 mL 둥근바닥플라스크에 옮겨 감압(또는 질소)농축한 후 메탄올 500 μL를 넣어 녹인다. 마이크로 원심분리관에 옮겨 상온에서 3,500 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

2) 연어, 장어
균질화한 시료 4 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 산화방지용액 1 mL와 황산암모늄 2 g을 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 내부표준물질 용액 400 μL를 넣은 후 60분간 평형화(equilibration) 시킨다. 유는 염화나트륨 1 g과 황산마그네슘 4 g을 넣고, 그 외는 염화나트륨 0.3 g을 넣어 5분간 흔들어 섞는다. ⓐ0.1% 암모니아 함유 아세토니트릴 5 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃에서 5,600 ×g로 20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를 넣는다. ⓑ잔류물에 0.1% 암모니아 함유 아세토니트릴 5 mL를 넣고 15분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃에서 5,600 ×g로 20분간 원심분리 후 상층액을 취하여 산화방지용액 50 μL를 넣는다. ⓐ와 ⓑ의 상층액을 합한 후 모아진 상층액을 MgSO4 900 mg, PSA(Primary Secondary Amine) 150 mg과 C18 150 mg이 담긴 15 mL 원심분리관에 옮겨 10분간 흔들어 섞어 추출한 후 상온에서 5,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 상층액을 둥근바닥플라스크에 옮겨 감압(또는 질소) 농축한 후 메탄올 500 μL를 넣고 녹인 후, 마이크로 원심분리관에 옮겨 상온에서 3,500 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 20 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	83	17
0.1	83	17
7.0	55	45
12.0	55	45
14.0	5	95
18.5	5	95
21.0	83	17
23.0	83	17

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	트리클라벤다졸 (Triclabendazole)	17.72	Positive	359.7	358.0	361	3461)	30
							274	44
							199	50
2	케토트리클라벤다졸 (Keto-triclabendazole)	16.57	Negative	329.5	328.0	327	181	24
							1461)	35
							118	45
3	옥시벤다졸-d7 (내부표준물질) (Oxibendazole-d7, IS)	11.00	Positive	256.2	256.2	257	225	16
							1771)	30
							149	42

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

트리클라벤다졸(17.72분)	케토트리클라벤다졸(16.57분)
옥시벤다졸-d7(내부표준물질)(11.0분)

4) 표준품 크로마토그램

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

트리클라벤다졸(Triclabendazole): 0.07 mg/kg(어류)

케토트리클라벤다졸(Triclabendazole): 0.09 mg/kg(어류)

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.22 엔라마이신(Enramycin)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 엔라마이신을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품(엔두라시딘)을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 이동상으로 희석하여 사용한다.

5) 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2): 500 mL 메스플라스크에 제이인산나트륨(Na2HPO4․H2O) 5.11 g과 제일인산나트륨(NaH2PO4․H2O) 1.68 g을 달아 물로 녹여 표시선까지 채운다.

6) 강 양이온교환 폴리머 카트리지(Strong Cation-exchange Polymer Cartridge): X-C(Styrene- divinylbenzene Polymer surfaced with a Strong Cation Exchanger Group) 또는 MCX(Mixed mode Cation Exchange) 카트리지(60 mg, 3 mL) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 6 mL를 넣고 완전히 혼합한 후 1,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. -20℃에서 30분간 방치하고 상층액 6 mL를 시험관에 옮기고 50℃ 이하에서 질소농축한 후, 잔류물은 0.2 M 인산완충용액(pH 7.2) 1 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 카트리지에 추출액을 흡착시키고 2% 포름산 수용액 3 mL로 4회 유출시켜 버린 후, 메탄올 2 mL 및 5% 수산화암모늄 함유 메탄올 2 mL로 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물은 이동상 0.1 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C8계 컬럼(2.0 mm × 50 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 5%(v/v) 아세토니트릴

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	100	0
3.0	100	0
4.0	80	20
10.0	10	90
12.0	10	90
13.0	100	0
18.0	100	0

다) 이동상 유량: 0.4 mL/분

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Spray voltage: 5 kV

다) Capillary temperature: 280℃

라) Sheath gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것(50 psi)

마) Auxiliary gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것(10 psi)

바) SIM ion: m/z 786

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성 및 확인시험
액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 질량분석기에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간(retention time)을 비교하고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 엔라마이신의 함량을 구한다.

8.3.23 살부타몰(Salbutamol), 시마테롤(Cimaterol)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 0.1 N 염산으로 추출한 후, 에틸아세테이트로 액-액 분배하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 5 N 수산화나트륨 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 수산화나트륨(sodium hydroxide) 200 g을 넣고 물로 녹여 표시선까지 채운다.

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

7) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1 N 염산 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 4,800 ×g, 4℃에서 15분간 원심분리 후 상층액 모두를 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. 상층액을 5 N수산화나트륨용액을 사용하여 pH를 12로 맞춘 다음, 에틸아세테이트 10 mL를 넣고 3분간 흔들어 섞는다. 4,800 ×g, 4℃에서 3분간 원심분리 후 상층액 중 5 mL를 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 0.1% 포름산 함유 수용액 1 mL를 넣고 녹인 후, 4,800 ×g, 4℃에서 3분간 원심분리하고 얻은 상층액을 멤브레인필터(PTFE, 0.2 μm)로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
0.5	95	5
6.5	60	40
7.0	0	100
11.0	0	100
11.2	95	5
15.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: Ar(아르곤) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	살부타몰 (Salbutamol)	3.5	239.3	239.2	240.2	148.11)	18
						222.2	10
						166.2	13
2	시마테롤 (Cimaterol)	3.7	219.2	219.1	220.0	202.11)	10
						160.1	16
						143.1	21

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

살부타몰(3.5분)	시마테롤(3.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

살부타몰(Salbutamol): 0.0002 mg/kg

시마테롤(Cimaterol): 0.0002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.24 클로람페니콜(Chloramphenicol)

가. 시험법 적용범위
벌꿀, 로열젤리 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 클로람페니콜을 물 또는 에틸아세테이트 등으로 추출한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지 또는 헥산을 이용하여 정제하고 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제한 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올:물(1:1, v/v)로 희석하여 사용한다.

5) Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone copolymer(충전제) 카트리지 컬럼: HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 벌꿀

균질화한 시료 5 g에 물 20 mL를 넣고 흔들어 섞어주며 녹인다. 이 액을 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL를 유출시켜 버린 후 활성화시킨 HLB 카트리지(충전제 60 mg)에 흡착시키고 20% 메탄올 수용액 5 mL로 유출시켜 버린 후, 60% 메탄올 수용액 6 mL로 용출하여 받는다. 용출액을 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 30% 아세토니트릴 수용액 1 mL에 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 로열젤리

균질화한 시료 1 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 ⓐ 메탄올:1% 메타인산 수용액(3:2, v/v) 혼합액 30 mL와 에틸아세테이트 15 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 3,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. ⓐ과정을 2번 반복하여 상층액을 합치고 취합한 상층액이 15 mL가 될 때까지 45℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축한다. 이 액을 미리 메탄올 10 mL와 물 10 mL를 유출시켜 버린 후 활성화시킨 HLB 카트리지(충전제 200 mg)에 흡착시키고 물 4 mL와 20% 메탄올 수용액 4 mL로 유출시켜 버린 후, 60% 메탄올 수용액 13 mL로 용출하여 받는다. 이때 용출액 중 처음 3 mL는 버리고 10 mL만 취한다. 취한 용출액은 45℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축하고 잔류물은 30% 아세토니트릴 수용액 1 mL에 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 함유한 0.1%(v/v) 초산(acetic acid) 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴:이동상 A(95:5, v/v) 혼합용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
15.0	10	90
15.5	80	20
30.0	80	20

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 20 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Scan width: 1.5 이하

다) Capillary temperature: 350℃

라) Auxiliary gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

마) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 헬륨(He) 또는 이와 동등한 것

바) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)
클로람페니콜 (Chloramphenicol)	323.1	322.0	321	1521) 176 194 257

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

클로람페니콜(Chloramphenicol): 0.0005 mg/kg(벌꿀)

클로람페니콜(Chloramphenicol): 0.005 mg/kg(로열젤리)

사. 정성 및 확인

액체크로마토그래프-질량분석기 상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.25 니트록시닐(Nitroxinil)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 포름산암모늄 함유 아세토니트릴:물(5:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 무수황산마그네슘(MgSO4)와 PSA(Primary Secondary Amine)로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 200 mM 포름산암모늄: 100mL 용량플라스크에 포름산암모늄 1.26 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 200 mM 포름산암모늄 0.1 mL과 물 2 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한 후, 상층액을 취한다. 무수황산마그네슘 900 mg과 PSA 150 mg을 미리 넣어 둔 50 mL 원심분리관에 상층액을 합한 후 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 15 mL 원심분리관에 취한 뒤, 50℃ 이하에서 4 mL가 되도록 질소 농축한다. 농축액을 1분간 흔들어 섞은 후, 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 5% 초산(acetic acid) 함유한 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
2.1	90	10
4.0	5	95
8.0	5	95
10.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 1.5 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성븐 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트록시닐 (Nitroxinil)	4.77	290.0	289.9	289	116	34
					1271)	26
					162	20

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

소고기	돼지고기
닭고기	알(卵)
유(乳)	새우
넙치	장어

니트록시닐(4.77분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

니트록시닐(Nitroxinil): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.26 티오우라실(Thiouracil)

가. 시험법 적용범위

축․수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 티오우라실을 아세토니트릴로 추출하고 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 이동상으로 희석하여 사용한다.

5) 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지: Silica 카트리지(500 mg, 10 mL)에 무수황산나트륨 1 g을 넣은 것 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞어 추출한다. 3,000 ×g에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 5 mL를 취하여 시험관에 옮긴 후 이를 60℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물을 디클로로메탄 0.5 mL에 충분히 녹인 후 5분간 초음파 추출한다. 이 추출액을 디클로로메탄 2 mL로 미리 활성화시킨 무수황산나트륨 함유 실리카 카트리지에 흡착시키고 디클로르메탄 0.5 mL로 추출액을 담았던 시험관에 넣고 초음파 추출하여 다시 카트리지에 흡착시킨다. 추출액이 흡착된 카트리지를 디클로로메탄 2 mL로 유출시켜 버리고, 시험관에 다시 메탄올:디클로로메탄(25:75, v/v) 혼합용액 2 mL를 넣고 1분간 초음파 추출한 용액으로 용출하여 받는다. 용출액을 60℃ 이하에서 질소농축하고 메탄올 200 μL와 0.1% 포름산 수용액 400 μL를 넣고 충분히 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(4.6 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A:  0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 포름산(formic acid):아세토니트릴:메탄올(1:500:500, v/v/v) 혼합용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	93	7
6.0	93	7
20.0	20	80
23.0	20	80
25.0	93	7
28.0	93	7

다) 이동상 유량: 0.5 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 330℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) Collision energy: 21～25 eV

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)
1	2-티오우라실 (2-Thiouracil)	128.1	128.0	129	84 1121)
2	6-메틸-2-티오우라실 (6-Methyl-2-thiouracil)	142.1	142.0	143	1261) 84
3	6-프로필-2-티오우라실 (6-Propyl-2-thiouracil)	170.2	170.1	171	1541) 112
4	6-페닐-2-티오우라실 (6-Phenyl-2-thiouracil)	204.2	204.0	205	1881) 146

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

티오우라실(Thiouracil): 0.025 mg/kg

사. 정성 및 확인

액체크로마토그래프-질량분석기 상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.27 플루메트린(Flumethrin)

가. 시험법 적용범위
벌꿀 등에 적용한다.

나. 분석원리
벌꿀에 물과 아세토니트릴을 넣고 흔들어 섞어 추출한 후 SPE(Solid Phase Extraction) 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올에 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 물 5 mL에 녹여 흔들어 섞어 추출한 뒤, 아세토니트릴 10 mL를 넣고 흔들어 섞어 추출한 뒤 1,000 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 옮기고 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 넣은 다음 1,000 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리한 뒤 상층액을 앞의 상층액과 합한다. 이 액에 염화나트륨 소량을 넣고 흔들어 섞은 후 1,000 ×g, 4℃에서 5분간 원심분리 한 다음, 상층액을 40℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축한 후 헥산 5 mL에 녹여 추출액으로 한다. 미리 헥산 10 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지(충전제 500 mg)에 추출액 2 mL를 흡착시키고 헥산:디클로로메탄(55:45, v/v) 혼합용액 10 mL로 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 메탄올 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상: 85%(v/v) 아세토니트릴

다) 이동상 유량: 1.0 mL/분

라) 측정파장: 266 nm

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

사. 정성시험

액체크로마토그래프의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 스펙트럼으로 확인한다.

아. 정량시험
시험용액 및 표준용액을 위의 조건에 따라 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 각 피크의 머무름 시간을 비교하여 피크의 높이 또는 면적으로 검량선을 작성하여 시료 중 플루메트린 함량을 구한다.

8.3.28 페닐부타존(Phenylbutazone)

8.3.28.1 제1법

가. 시험법 적용범위
축산물(가금류 제외) 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 페닐부타존을 에틸아세테이트로 추출하고 실리카 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올 80 mL와 25% D,L-디티오트레이톨(dithiothreitol) 5 mL에 녹인 후 메탄올로 표시선을 맞춰 100 mg/L로 조제한 액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.2 N 초산:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

5) 25% D,L-디티오트레이톨: D,L-디티오트레이톨 125 mg을 에틸아세테이트 500 mL에 녹인다. 당일 제조하여 사용한다.

6) 실리카 카트리지: Silica 카트리지(500 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 메탄올:25% D,L-디티오쓰레이톨(1:7, v/v) 혼합용액 15 mL를 넣은 후 10분간 흔들어 섞어 추출한다. 3,000 ×g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 농축플라스크에 취한다. 잔류물에 메탄올:25% D,L-디티오트레이톨(1:7, v/v) 혼합용액 15 mL를 넣은 후 위의 과정을 한 번 더 반복한다. 모은 상층액은 50℃ 이하에서 감압(또는 질소) 농축하고 잔류물은 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran):헥산(1:4, v/v) 혼합용액 15 mL를 3번에 나누어 녹인다. 이 용액을 미리 테트라하이드로퓨란:헥산(1:4, v/v) 혼합용액 5 mL로 활성화시킨 실리카 카트리지에 넣어 용출하여 받는다. 이 용출액은 50℃ 이하에서 감압(또는 질소)농축하고 잔류물은 0.2 N 초산:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 2 mL에 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(1.5 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상: 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 함유 5%(v/v) 초산(acetic acid) 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) Collision energy: 21 eV

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관즉질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision energy, eV)
페닐부타존 (Phenylbutazone)	308.3	308.2	307	160 188 2791)	21

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

페닐부타존(Phenylbutazone): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.28.2 제2법

가. 시험법 적용범위

축산물(가금류) 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 페닐부타존을 아세트산(acetic acid), 염화나트륨(sodium chloride), 아세트산암모늄(ammonium acetate), 아세토니트릴:디클로로메탄(85:15, v/v) 혼합용액으로 추출하고 PSA(Primary Secondary Amine), C18, 황산마그네슘(MgSO4)으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 2 mM 아세트산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 0.154 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 2 mM 아세트산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 0.154 g을 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 100 mM 아세트산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산암모늄 7.708 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 100 mM 아세트산암모늄 용액 1 mL, 아세토니트릴:디클로로메탄(85:15, v/v) 혼합용액 5 mL와 NaCl 1 g, 아세트산 0.05 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 2,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액을 취하여 새로운 원심분리관에 옮긴다. MgSO4 37.5 mg, PSA 6.25 mg, C18 6.25 mg을 넣은 뒤 1분간 흔들어 섞은 후, 2,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액 중 15 mL 튜브에 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 아세토니트릴 0.4 mL를 넣어 녹이고 1분간 흔들어 섞은 후 3분간 초음파 분쇄한다. 13,500 ×g, 4℃에서 3분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 2 mM 아세트산암모늄(ammonium acetate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 2 mM 아세트산암모늄(ammonium acetate) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.00	100	0
0.20	100	0
5.50	45	55
6.00	0	100
8.50	0	100
8.51	100	0
13.00	100	0

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Interface temperature: 300℃

다) Interface voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
페닐부타존 (Phenylbutazone)	6.90	308.4	308.2	309.2	1201)	18
					160	18
					190	14

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

페닐부타존(6.9분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

페닐부타존(Phenylbutazone): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.29 클라불라닌산(Clavulanic acid)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 클라불라닌산을 인산완충용액 또는 아세토니트릴로 추출하고 디클로로메탄으로 지방을 제거하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 표준원액: 표준품을 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0)으로 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

3) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0)으로 희석하여 사용한다.

4) 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0): 각각의 100 mL 메스플라스크에 제일인산칼륨(KH2PO4) 0.9 g과 제이인산나트륨(Na2HPO4·12H2O) 2.36 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지 채운다. 두 용액을 71:29(v/v)의 비율로 혼합한다.

5) 원심필터 unit: Microcon YM-30 Centrifugal filter device(cut-off 30 kDa) 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳)
균질화한 시료 1 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 1 mL를 넣고 5분간 강하게 흔들어 섞는다. 이 용액을 1,800 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 취하고 디클로로메탄 2 mL를 넣은 후 5분간 강하게 흔들어 섞는다. 이 용액을 다시 1,800 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액 0.4 mL를 1.5 mL 원심분리관에 옮겨 16,000 ×g에서 10분간 다시 원심분리한 후 상층액을 취하여 시험용액으로 한다.

2) 유(乳)외 식품
균질화한 시료 1 g을 15 mL 원심분리관에 취하고 0.066 M 인산완충용액(pH 6.0) 5 mL를 넣고 5분간 강하게 흔들어 섞는다. 이 용액을 1,800 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액 1 mL를 원심분리관에 취하고 다시 16,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액 0.5 mL를 취하고 원심필터 unit을 이용하여 4℃, 10,000 ×g에서 30분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C8계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도: 35℃

다) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	98	2
1.9	98	2
5.0	80	20
12.0	98	2

라) 이동상 유량: 0.25 mL/분

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 550℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) Collision energy: 12 eV

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌 에너지 (Collision energy)
클라불라닌산 (Clavulanic acid)	199.1	199.0	198	1361) 108 112	12

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 정량한계

클라불라닌산(Clavulanic acid): 0.1 mg/kg(유(乳))

클라불라닌산(Clavulanic acid): 0.02 mg/kg(유(乳)외 식품)

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.30 플로르페니콜(Florfenicol)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 플로르페니콜과 플로르페니콜아민을 암모니아수(ammonia water), 아세토니트릴로 추출하고 PSA, C18, MgSO4으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산(formic acid) 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취한다. 아세토니트릴 10 mL와 암모니아수 100 μL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 모두 취하여 PSA 150 mg, C18 150 mg과 MgSO4 900 mg가 담겨진 50 mL 원심분리관에 옮기고 1분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액 중 5 mL를 취하여 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 아세토니트릴:물(30:70, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣어 녹이고, 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ⨯150 mm, 3.5 μm)또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
1.0	90	10
3.0	10	90
5.0	10	90
5.1	90	10
10.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 3.8 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	플로르페니콜 (Florfenicol)	4.23	Negative	358.2	357.0	356.0	3361)	10
							185	16
							152	19
2	플로르페니콜 아민 (Florfenicol amine)	1.75	Positive	247.2	247.1	248.0	2301)	11
							130	21
							91	48

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

플로르페니콜(4.2분)

플로르페니콜 아민(1.8분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

플로르페니콜(Florfenicol): 0.005 mg/kg

플로르페니콜 아민(Florfenicol amine): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.31 피란텔(Pyrantel)

가. 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 아세토니트릴 포화 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래피용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 20 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 0.1% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL와 포름산암모늄 1.26 g을 넣고 녹인 후 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.2% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 2 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞고 상온에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 50 mL 원심분리관에 옮기고 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣은 후 10분간 흔들어 섞고 상온에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 하층액을 취한 뒤, 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물에 0.1% 포름산 수용액 2 mL와 메탄올 2 mL를 넣어 녹인 뒤 10분간 초음파 처리한 후 4℃에서 4,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 20 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
2.1	90	10
4.0	5	95
8.0	5	95
10.0	90	10
11.0	90	10

(2) 이동상 B: 0.2%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary voltage: 0.5 kV

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) Capillary temperature: 350℃

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
피란텔 (Pyrantel)	4.48	206.3	206.1	207.3	97.0	18
					135.9	26
					150.01)	24

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

피란텔(4.5분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

피란텔(Pyrantel): 0.0005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.32 덱사메타손(Dexamethasone), 메틸프레드니솔론(Methylprednisolone), 베타메타손(Betamethasone), 알도스테론(Aldosterone), 코르티손(Cortisone), 코르티코스테론(Corticosterone), 프레드니손(Prednisone), 프레드니솔론(Prednisolone), 플루메타손(Flumethasone)

가. 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고, C18 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 10% 아세토니트릴으로 희석하여 사용한다.

5) 3 M 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨 246.1 g을 넣고 물 500 mL로 충분히 녹인 후 초산을 이용하여 pH를 4.6으로 맞추고 물로 표시선까지 채운다.

6) 20% 아세톤 수용액: 100 mL 용량플라스크에 아세톤을 20 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량 플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) C18 카트리지(6 mL, 500 mg) 또는 이와 동등한 것

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 3 M 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 10 mL를 넣은 뒤 흔들어 섞는다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/arylsulfatase) 50 μL를 넣고 흔들어 섞어 추출하고 60℃ 오븐에 1시간 동안 넣어 둔 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 0℃에서 5,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 취한다. 이런 과정을 한번 더 반복하여 얻어진 상층액에 헥산 8 mL와 디클로르메탄 2 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 하층액을 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축하고 잔류물을 메탄올 1 mL와 물 10 mL로 녹인 것을 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 C18 카트리지에 추출액을 흡착시킨다. 물 5 mL, 20% 아세톤 수용액 5 mL, 헥산 5 mL를 차례로 유출시켜 버린 후 진공 감압하여 물을 완전히 제거해준다. 에틸아세테이트 6 mL로 용출하여 받고 50℃ 이하에서 질소 농축한 후 잔류물에 10% 아세토니트릴 1 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

사. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ｘ 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	70	30
7.0	70	30
8.5	10	90
12.0	10	90
14.0	70	30
16.0	70	30

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Capillary voltage: Positive(5.0 kV)/Negative(3.0 kV)

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	덱사메타손 (Dexamethasone)	7.8	Negative	392.5	392.2	437.2	292.0	38
							307.1	33
							361.11)	20
							391.1	15
2	메틸프레드니솔론 (Methyl prednisolone)	7.0	Negative	374.5	374.2	419.2	294.0	38
							309.1	34
							343.11)	20
							373.1	14
3	베타메타손 (Betamethasone)	7.4	Negative	392.5	392.2	437.2	292.1	37
							307.0	30
							324.8	32
							361.11)	20
4	알도스테론 (Aldosterone)	3.8	Positive	360.4	360.2	361.2	255.1	17
							315.01)	17
							325.1	14
							343.2	15
5	코르티손 (Cortisone)	5.0	Positive	360.4	360.2	361.2	105.1	32
							121.1	31
							145.1	30
							163.11)	23
6	코르티코스테론 (Corticosterone)	9.2	Positive	346.5	346.2	347.2	121.1	25
							293.11)	14
							311.2	16
							329.1	12
7	프레드니손 (Prednisone)	4.6	Negative	358.4	358.2	403.2	299.1	47
							327.11)	20
							357.1	19
							187.0	12
8	프레드니솔론 (Prednisolone)	4.5	Negative	360.4	360.2	405.2	187.0	31
							280.11)	37
							295.1	32
							329.1	19
9	플루메타손 (Flumethasone)	7.6	Negative	410.5	410.2	455.2	305.1	40
							363.1	27
							379.11)	20
							409.1	15

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

프레드니손(4.6분)

프레드니솔론(4.5분)

메틸프레드니솔론(7.1분)

베타메타손(7.4분)

덱사메타손(7.8분)

플루메타손(7.1분)

코르티코스테론(9.2분)

코르티손(5.0분)

알도스테론(3.8분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

덱사메타손(Dexamethasone): 0.0001 mg/kg

메틸프레드니솔론(Methyl prednisolone): 0.0001 mg/kg

베타메타손(Betamethasone): 0.0001 mg/kg

알도스테론(Aldosterone): 0.005 mg/kg

코르티손(Corticosterone): 0.002 mg/kg

코르티코스테론(Corticosterone): 0.002 mg/kg

프레드니손(Prednisone): 0.0001 mg/kg

프레드니솔론(Prednisolone): 0.0001 mg/kg

플루메타손(Flumethasone): 0.001 mg/kg

아. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

자. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.33 톨페남산(Tolfenamic acid)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 톨페남산을 아세토니트릴로 추출하고, 헥산으로 지방 및 불순물을 제거한 후 pH를 맞춘 뒤 에틸아세테이트로 액-액 추출하여 액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(UV photometric detector)로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-자외선흡광검출기(HPLC-UVD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
시료 5 g에 아세토니트릴을 10 mL씩 2회 넣고 20분간 흔들어 섞는다. 4,800 ×g에서 10분간 원심분리한 다음 상층액을 취해 헥산 20 mL를 넣고 흔들어 섞은 뒤 방치하여 층을 분리시킨다. 하층을 모아 50℃ 이하에서 질소 농축 후 잔류물을 에테르 4 mL로 녹여, 10분간 흔들어 섞고, 2 mM NaOH 수용액 10 mL(4 mL, 4 mL, 2 mL씩 세 번), NaCl 포화용액을 2 mM NaOH 수용액 1 mL당 75 μL씩 넣어 20분간 흔들어 섞어 추출한 후 4,700 ×g에서 10분간 원심분리한다. 하층을 취해 새 튜브에 담은 후 2% 아세트산 수용액 600 μL를 넣고 약산성화 시킨다. 에틸아세테이트 40 mL(20 mL, 10 mL, 10 mL씩 세 번)를 넣고 20분간 흔들어 섞어 추출한 후 4,700 ×g에서 5분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축 후 다시 에틸아세테이트 5 mL(2 mL, 2 mL, 1 mL씩 세 번)로 녹여 50℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 메탄올 500 μL를 넣고 10분간 흔들어 섞어 준 뒤, 4,700 ×g에서 2분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도: 40℃

다) 이동상: 0.1% 초산(acetic acid) 수용액:아세토니트릴(50:50, v/v) 혼합용액

라) 이동상 유량: 1.0 mL/분

마) 주입량: 10 μL

바) UV 검출기 파장: 218 nm

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

3) 표준품 크로마토그램

톨페남산(12.6분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

4) 정량한계

톨페남산(Tolfenamic acid): 0.01 mg/kg(축산물, 유(乳))

사. 정성시험

액체크로마토그래프-자외선흡광검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 스펙트럼으로 확인한다.

아. 정량시험

표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을 비교하여 톨페남산의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 톨페남산 함량을 구한다.

자. 확인시험

1) 액체크로마토그래프-질량분석기 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 150 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.2% 초산암모늄(ammonium acetate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	80	20
1	80	20
12	0	100
13	0	100
14	80	20
17	80	20

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

바) Capillary temperature: 300℃

사) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
톨페남산 (Tolfenamic acid)	261.7	261.1	260	216 260	16

8.3.34 사이퍼메트린(Cypermethrin)

가. 시험법 적용범위

축산물(알(卵) 제외) 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 사이퍼메트린을 아세토니트릴과 황산마그네슘을 넣어 추출하고, Florisil 카트리지로 정제한 후 기체크로마토그래프-전자포획검출기(electron capture detector)로 분석한다.

다. 장치

기체크로마토그래프-전자포획검출기(electron capture detector)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세톤에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세톤으로 희석하여 사용한다.

5) SPE 카트리지: Florisil 카트리지(6 mL, 500 mg) 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 추출

균질화한 시료 5 g에 아세토니트릴 20 mL와 황산마그네슘 2 g을 넣고 10분간 흔들어 섞어 추출한 후 4,500 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 다시 아세토니트릴 10 mL를 넣고 위 과정을 반복한다. 상층액을 이전의 상층액과 합한 뒤, 감압(또는 질소)농축하고 잔여물을 헥산 5 mL로 녹인 용액을 추출액으로 한다.

2) 정제
미리 헥산 5 mL로 활성화시킨 Florisil 카트리지에 추출액을 흡착시키고, 헥산 10 mL로 유출시켜 버린 후 60% 디클로로메탄 함유 헥산 10 mL로 용출하여 받는다. 용출액을 감압(또는 질소) 농축한 다음 잔류물을 아세톤 2 mL로 녹인 후 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HP-5(30 m × 250 μm × 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 이동상 유량: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것, 1 mL/분

다) 오븐 온도: 200℃에서 시험용액을 주입하여 1분간 유지한 후, 5℃/분의 비율로 290℃까지 온도를 상승시키고 2분간 유지한다.

라) 주입부 온도: 250℃

마) 주입부: Split mode(10:1)

바) 주입량: 1 μL

사) Make-up flow: 60 mL/분, 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

아) 검출부: 280℃

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프-전자포획검출기에 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

3) 표준품 크로마토그램

사이퍼메트린(16.3, 16.5, 16.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

4) 정량한계

사이퍼메트린(Cypermethrin): 0.1 mg/kg(유(乳))

사이퍼메트린(Cypermethrin): 0.05 mg/kg(유(乳)를 제외한 식품, 소고기)

사. 정성시험

기체크로마토그래프-전자포획검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간으로 확인한다.

아. 정량시험

표준용액 및 시험용액을 각각 기체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을 비교하여 사이퍼메트린의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 사이퍼메트린 함량을 구한다.

자. 확인시험

1) 기체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: BR-5MS(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 이동상 유량: 헬륨(He) 또는 이와 동등한 것, 0.8 mL/분

다) 오븐 온도: 70℃에서 3분간 유지하고 20℃/분의 비율로 180℃까지 온도를 상승시킨 후 다시 5℃/분의 비율로 300℃까지 상승시켜 7.5분간 유지한다.

라) 주입부 온도: 280℃

마) 주입부: Split mode(10:1)

바) 주입량: 1 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) Source temperature: 200℃

나) Interface 온도: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
사이퍼메트린 (Cypermethrin)	16.3, 16.5, 16.7	416.3	415.1	181	180 152	10

8.3.35 피페라진(Piperazine)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 피페라진을 2% 포름산 수용액으로 추출하고, SPE(PCX) 카트리지로 정제한 후, 액체크로마토그래프-형광검출기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-형광검출기(HPLC-FLD)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물로 희석하여 사용한다.

5) SPE 카트리지: Bond Elut Plexa PCX 카트리지(200 mg, 6 mL) 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳)

균질화한 시료 5 mL에 2% 포름산 함유 아세토니트릴 3 mL를 넣은 뒤, 20분간 흔들어 섞어 추출한 다음 2% 포름산 수용액 12 mL를 넣은 뒤, 20분간 흔들어 섞어 추출한다. 이를 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 tube에 모아 40℃ 이하에서 17 mL 이하로 질소농축한다. 미리 메탄올 3 mL와 2% 포름산 수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2% 포름산 수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로 유출시켜 버린 후, 5% 메탄올성 수산화암모늄 용액 3 mL로 2회 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소농축한 다음, 0.1% 트리에틸아민(TEA) 1 mL로 녹이고 20분간 흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에 녹인 단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를 넣고 암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 알(卵)

균질화한 시료 5 mL에 2% 포름산 함유 아세토니트릴 6 mL를 넣은 뒤, 20분간 흔들어 섞어 추출한 다음 2% 포름산 수용액 10 mL를 넣고 20분간 흔들어 섞어 추출한다. 이를 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 tube에 모아 40℃ 이하에서 10 mL 이하로 질소농축한다. 미리 메탄올 3 mL와 2% 포름산 수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2% 포름산 수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로 유출시켜 버린 후, 5% 수산화암모늄 함유 메탄올 3 mL로 2회 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소 농축한 다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로 녹이고 20분간 흔들어 섞어 추출한 후, 아세토니트릴에 녹인 단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를 넣고 암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

3) 유(乳), 알(卵)을 제외한 식품

균질화한 시료 5 g에 2% 포름산 수용액 15 mL를 넣은 뒤, 20분간 흔들어 섞어 추출한 다음 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 새로운 tube에 모은다. 남은 침전물에 다시 2% 포름산 수용액 10 mL를 넣고 20분간 흔들어 섞어 추출한 다음 4,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 상층액을 이전의 상층액과 합하여 추출액으로 한다. 미리 메탄올 3 mL와 2% 포름산 수용액 3 mL로 활성화시킨 PCX cartridge에 추출액을 흡착시킨 다음 2% 포름산 수용액 3 mL와 메탄올 3 mL를 차례로 유출시켜 버린 후, 5% 수산화암모늄 함유 메탄올 3 mL로 2회 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소농축한 다음, 0.1% 트리에틸아민 1 mL로 녹이고 20분간 흔들어 섞어 추출한다. 아세토니트릴에 녹인 단실염화물 용액(0.5 mg/mL) 1 mL를 넣고 암실에서 40℃ 항온수조에 30분간 반응시킨 다음, 이를 0.45 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(4.6 mm × 250 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상: 물:아세토니트릴(30:70, v/v) 혼합용액

다) 이동상 유량: 1.0 mL/분

라) 주입량: 20 μL

마) 컬럼 온도: 30℃

바) 측정파장: 여기파장-338 nm, 측정파장-523 nm

2) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

3) 표준품 크로마토그램

피페라진(17.4분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

4) 정량한계

피페라진(Piperazine)：0.02 mg/kg

사. 정성시험

액체크로마토그래프-형광검출기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간으로 확인한다.

아. 정량시험

표준용액 및 시험용액을 각각 액체크로마토그래프에 주입한다. 얻어진 피크 머무름 시간을 비교하여 피페라진의 피크 면적으로 검량선을 작성하고 시험용액 중 피페라진 함량을 구한다.

자. 확인시험

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 아세트산(acetic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
3.0	95	5
5.0	0	100
15.0	0	100
15.1	95	5
20.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 20℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capilary voltage: 5,500 V

라) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
피페라진 (DNS-Cl-piperazine)	17.4	319.4	319.1	320.1	170.1 154.2	35 71

8.3.36 아크리놀(Acrinol), 트리암시놀론(Triamcinolone)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 포름산 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1 % 포름산 함유 아세토니트릴: 1 L 용량플라스크에 포름산 1 mL 넣은 후 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관①에 취하고 0.1 % 포름산 함유 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다(유(乳)의 경우, 0.1 % 포름산 함유 아세토니트릴 10 mL와 황산나트륨 5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞는다.). 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관②에 옮긴다. 원심분리 후 남은 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞고 다시 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 나온 상층액을 앞의 원심 분리관②에 합한다. 이 원심분리관②에 헥산 20 mL를 넣고 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 나온 하층액을 추출액으로 한다. 추출액을 50℃ 이하에서 질소농축하고 0.1% 포름산 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣고 충분히 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과시켜 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
5	95	5
10	0	100
20	0	100
21	95	5
30	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 20℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	아크리놀 (Acrinol)	16.0	343.4	343.2	254	169	57
						1971)	47
						226	39
2	트리암시놀론 (Triamcinolone)	16.6	394.4	394.2	395	1151)	113
						121	53
						357	41
1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아크리놀(16.0분)

트리암시놀론(16.6분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

아크리놀(Acrinol): 0.005 mg/kg

트리암시놀론(Triamcinolone): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.37 구아이페네신(Guaifenesin)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관①에 취하고 아세토니트릴 8 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞는다(유(乳)의 경우, 균질화한 시료 5 mL를 50 mL 원심 분리관①에 취하고 황산나트륨 5 g과 아세토니트릴 8 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞는다.). 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심 분리관②에 옮긴다. 원심분리 후 남은 잔류물에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 다음 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 원심 분리관②에 합한다. 이 원심 분리관②에 헥산 15 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 하층액을 추출액으로 한다. 추출액을 50℃ 이하에서 질소농축하고 메탄올 1 mL로 녹여 4℃, 15,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 0.2 μm 멤브레인필터로 여과시켜 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
7	95	5
13	0	100
25	0	100
30	95	5
35	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 25℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350 ℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
구아이페네신 (Guaifenesin)	18.2	198.2	198.1	199	135	19
					137	25
					1511)	15

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

구아이페네신(18.2분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

구아이페네신(Guaifenesin): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.38 펜타메틸렌테트라졸(Pentamethylenetetrazole)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 포름산 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관①에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 8 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞는다(유(乳)의 경우, 균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관①에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 8 mL와 황산나트륨 5 g을 넣은 후 5분간 흔들어 섞는다.). 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관②에 옮긴다. 원심분리 후 남은 잔류물에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 원심분리관②에 합한다. 이 원심분리관②에 헥산 15 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 하층액을 추출액으로 한다. 추출액을 40℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물을 메탄올 1 mL로 녹여 4℃, 15,000 ×g에서 5분간 원심분리한 후, 0.2 μm 멤브레인필터로 여과시켜 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액

(2) 이동상 B: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
3	95	5
4	0	100
15	0	100
20	95	5
25	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 25℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
펜타메틸렌테트라졸 (Pentamethylene tetrazole)	9.4	138.1	138.1	139	55	35
					69	39
					961)	23

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

펜타메틸렌테트라졸(9.4분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

펜타메틸렌테트라졸(Pentamethylenetetrazole): 0.001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.39 카르바콜(Carbachol)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 약양이온교환(WCX) 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 약양이온교환 카트리지: WCX(Weak Cation Exchange) 카트리지(6 mL, 500 mg) 또는 이와 동등한 것

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관①에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관②에 옮긴다. 원심분리 후 남은 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 넣고 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 원심 분리관②에 합하고 이 액을 추출액으로 한다. 추출액을 50℃ 이하에서 질소농축하고 물 10 mL를 넣고 충분히 녹인 후, 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 약양이온교환(WCX) 카트리지에 흡착시키고 5% 수산화암모늄으로 유출시켜 버린 후 메탄올 5 mL와 2% 포름산 함유 메탄올 5 mL로 용출하여 받는다. 용출액을 50℃ 이하에서 질소농축하고 아세토니트릴 1 mL를 넣고 충분히 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	5	95
2	5	95
5	60	40
12	60	40
13	5	95
20	5	95

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 20℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
카르바콜 (Carbachol)	10.4	182.6	182.1	147	45	39
					60	17
					881)	23

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

카르바콜(10.4분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

카르바콜(Carbachol): 0.003 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.40 아미노피린(Aminopyrine)

가. 시험법 적용범위
축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중의 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 지방을 제거한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치
액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제
균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관①에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣은 뒤 5분간 흔들어 섞는다(유(乳)의 경우, 균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관①에 취하고 아세토니트릴 10 mL와 황산나트륨 5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞는다.). 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심 분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관②에 옮긴다. 원심분리 후 남은 잔류물에 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 원심분리관②에 합한다. 이 원심분리관②에 헥산 20 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 하층액을 추출액으로 한다. 추출액을 50℃ 이하에서 질소농축하고 잔류물에 아세토니트릴 1 mL를 넣고 충분히 녹인 후 0.2 μm 멤브레인필터로 여과시켜 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 초산암모늄(ammonium acetate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	5	95
2.0	5	95
3.0	60	40
3.5	60	40
4.0	95	95
10.0	95	95

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 20℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
아미노피린 (Aminopyrine)	2.5	231.2	231.1	232	97	39
					111	53
					1131)	19

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아미노피린(2.5분)

그림. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

아미노피린(Aminopyrine): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.41 티오파네이트(Thiophanate)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 삼불화초산 함유 아세토니트릴과 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고 C18과 황산마그네슘을 이용한 분산고체상추출법(d-SPE, dispersive-solid phase extraction)으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 삼불화초산(trifluoroacetic acid, TFA) 함유 아세토니트릴: 1000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.2% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 2 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 10 mM 포름산암모늄 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 삼불화초산 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞는다. 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 5분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액을 취하여 50℃ 이하에서 10 mL가 되도록 질소농축한다. 여기에 C18 150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣어 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축한 후 이동상A 0.5 mL와 이동상B 0.5 mL에 녹여 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.2%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액:10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액(1:1, v/v) 혼합용액

(2) 이동상 B: 0.2%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액:10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0	100	0
5	100	0
10	0	100
25	0	100
26	100	0
35	100	0

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) Ionization mode: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
티오파네이트 (Thiophanate)	15.04	370.5	370.1	371.0	1511)	33
					93	97
					118	97

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

티오파네이트(15.04분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

티오파네이트(Thiophanate): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.42 폴리믹신 비(Polymyxin B)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 삼염화초산 함유 아세토니트릴과 삼불화초산으로 추출하여 Plexa 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.1% 포름산 수용액으로 희석하여 사용한다.

5) Plexa 카트리지: N-vinylpyrrolidine과 divinylbenzene이 copolymer의 형태로 결합된 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

8) 10% 삼염화초산(trichloroacetic acid) 함유 아세토니트릴: 100 mL 용량플라스크에 삼염화초산 10 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10% 삼염화초산 함유 아세토니트릴 3 mL를 넣은 후 5분간 흔들어 섞어 추출한 후 0.5% 삼불화초산 수용액 12 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 4℃, 2,600 ×g에서 20분간 원심분리하고 상층액을 50 mL 원심분리관에 옮긴 후, 40℃ 이하에서 질소농축하여 농축액의 양이 12 mL 이하가 되도록 한다. 이를 1분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 15,000 ×g에서 20분간 원심분리한다. 미리 메탄올 5 mL과 물 5 mL로 Plexa 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 2% 메탄올 수용액 5 mL로 2회 유출시켜 버린다. 새로운 원심분리관에 2% 포름산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 10 mL로 용출하여 받은 후, 40℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물은 0.1% 포름산 수용액 1 mL로 녹여 1분간 흔들어 섞은 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
4	95	5
8	30	70
16	30	70
20	95	5
25	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 20℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
폴리믹신 B (Polymyxin B)	11.48	1203.5	1202.7	402	3961)	19
					241	21
					202	23

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

폴리믹신 비(11.5분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

폴리믹신 비(Polymyxin B): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.43 페노티아진(Phenothiazine)

가. 시험법 적용범위

축산물(식육) 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 포름산과 포름산암모늄 함유 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.2% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 2 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 10 mM 포름산암모늄과 0.2% 포름산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL에 녹인 후 0.2% 포름산 함유 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 0.2% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 2 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

9) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심 분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄과 0.2% 포름산 함유 아세토니트릴 혼합용액 20 mL 넣은 뒤 5분간 흔들어 섞는다. 이를 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하여 상층액을 취한 뒤 헥산 20 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 50℃ 이하에서 질소농축한 후 잔류물을 아세토니트릴 3 mL로 녹인 뒤 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심 분리하여 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.2%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액:10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액(1:1, v/v) 혼합용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
5	70	30
15	70	30
20	95	5
25	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
페노티아진 (Phenothiazine)	13.0	199.2	199.1	199	1671)	33
					166	39
					139	53

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

페노티아진(13.0분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

페노티아진(Phenothiazine): 0.001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.44 푸마길린(Fumagillin)

가. 시험법 적용범위

꿀 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 물로 추출하고 Strata-X 카트리지로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) Strata-X 카트리지: 고정상이 충전되어 있는 일회용 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

8) 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

9) 10 mM 포름산암모늄 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

10) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 미리 메탄올 5 mL과 물 5 mL로 Strata-X 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 40% 메탄올 5 mL로 2회 유출시켜 버린다. 새로운 원심분리관에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 6 mL로 용출하여 받은 후, 40℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물을 0.1% 포름산 수용액:10 mM 포름산암모늄 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1 mL로 녹이고 1분간 흔들어 섞은 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액:10mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액(1:1, v/v) 혼합용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 수용액:10mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
5	95	5
10	5	95
20	5	95
25	95	5
30	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

라) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
푸마길린 (Fumagillin)	16.62	458.5	458.2	459	1311)	41
					177	21
					103	83

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

푸마길린(16.6분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

푸마길린(Fumagillin)：0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.45 니스타틴(Nystatin), 메토미데이트(Metomidate), 부파바쿠온(Buparvaquone), 아르사닐산(Arsanilic acid)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 니스타틴 표준품을 DMSO(dimethyl sulfoxide), 부파바쿠온, 메토미데이트, 아르사닐산 표준품은 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣어 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소농축한다. 농축액에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 0.5 mL를 넣어 녹이고 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	100	0
5	100	0
7	5	95
17	5	95
20	100	0
25	100	0

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	니스타틴 (Nystatin)	11.28	926.1	925.5	926.58	297.01)	39
						691.3	33
						673.3	33
2	메토미데이트 (Metomidate)	11.72	230.2	230.1	231.15	127.11)	13
						95.1	29
						105.1	27
3	부파바쿠온 (Buparvaquone)	16.87	326.4	326.2	327.23	189.01)	29
						115.1	67
						57.1	53
4	아르사닐산 (Arsanilic acid)	11.74	217.0	217.0	218.08	92.31)	19
						109.1	21
						200.0	15

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

니스타틴(11.3분)	메토미데이트(11.7분)
부파바쿠온(16.9분)	아르사닐산(11.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

니스타틴(Nystatin): 0.005 mg/kg

메토미데이트(Metomidate): 0.005 mg/kg

부파바쿠온(Buparvaquone): 0.005 mg/kg

아르사닐산(Arsanilic acid): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.46 나이트록소린(Nitroxoline)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴과 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고 C18과 황산마그네슘으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 0.1% 삼불화초산 함유 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.1% 삼불화초산 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 삼불화초산(trifluoroacetic acid, TFA) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 삼불화초산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 삼불화초산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 여기에 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣어 15분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하고, C18 150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣어 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 15 mL 원심분리관에 취하여 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소농축한다. 농축액에 0.1% 삼불화초산 함유 아세토니트릴 1.5 mL를 넣은 뒤 녹이고 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 삼불화초산(trifluoroacetic acid, TFA) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v)  삼불화초산(trifluoroacetic acid, TFA) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
3	95	5
6	5	95
13	5	95
15	95	5
20	95	5

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
나이트록소린 (Nitroxoline)	9.10	190.1	190.0	191.2	145.11)	27
					127.0	43
					117.1	41

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

나이트록소린(9.10분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

나이트록소린(Nitroxoline): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.47 데하이드로콜산(Dehydrocholic acid), 안트라닐산(Anthranilic acid)

가. 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다(단, 데하이드로콜산은 축산물에만 적용한다).

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소농축한다. 농축액에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 1.5 mL를 넣고 녹인 뒤 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	100	0
3	100	0
5	5	95
15	5	95
17	100	0
20	100	0

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	데하이드로콜산 (Dehydrocholic acid)	10.19	Negative	402.5	402.2	401.2	249.31)	44
							331.3	24
							215.3	46
2	안트라닐산 (Anthranilic acid)	9.70	Positive	137.1	137.1	138.2	91.81)	20
							65.0	44
							120.0	50

1) 정량이온

3) 검량선 작성

표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

데하이드로콜산(10.19분)

안트라닐산(9.70분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

데하이드로콜산(Dehydrocholic acid): 0.005 mg/kg

안트라닐산(Anthranilic acid): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.48 메텐아민(Methenamine)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴로 추출한 뒤 헥산과 황산마그네슘, PSA(Primary Secondary Amine)으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 900 mg과 PSA 50 mg을 넣고 5분간 흔들어 섞은 뒤 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소농축한 후 농축액에 아세토니트릴 1.5 mL를 넣어 녹인다. 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	25	75
10	25	75

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
메텐아민 (Methenamine)	3.74	Positive	140.1	140.1	141.2	112.01)	17
						42.1	37
						85.1	21

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

메텐아민(3.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

메텐아민(Methenamine): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.49 수소산브롬글루타민 마그네슘염(L-Glutamic acid magnesium salt hydrobromide), 아미노메탄설폰산(Aminomethanesulfonic acid)

가. 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로 추출하고 원심분리하여 얻어진 상층액을 헥산으로 정제하여 농축한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 물에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물 20 mL로 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하고 헥산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 취하고 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소 농축한다. 농축액에 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 1.5 mL를 넣어 녹이고, 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	35	65
10	35	65

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	수소산브롬글루타민 마그네슘염 (L-Glutamic acid magnesium salt hydrobromide)	1.61	250.3	248.9	145.9	102.11)	16
						128.2	16
						74.1	24
2	아미노메탄설폰산 (Aminomethane- sulfonic acid)	1.64	111.1	111.0	109.8	81.01)	16
						80.0	28
						64.0	56

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

수소산브롬글루타민 마그네슘염(1.61분)

아미노메탄설폰산(1.64분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

수소산브롬글루타민 마그네슘염(L-Glutamic acid magnesium salt hydrobromide): 0.005 mg/kg

아미노메탄설폰산(Aminomethanesulfonic acid): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.50 하이드록시디메틸피리미딘(2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine)

가. 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 물 20 mL와 포름산암모늄 0.63 g을 넣고 잘 녹인 뒤 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 10 mM 포름산암모늄 함유 아세토니트릴 20 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하고 여기에 헥산 20 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 담아 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소농축한 후 농축액에 아세토니트릴 1.5 mL를 넣어 녹이고 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 얻은 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	25	75
10	25	75

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
하이드록시디메틸피리미딘 (2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine)	1.89	124.1	124.1	125.1	82.21)	23
					42.2	43
					107.1	21

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

하이드록시디메틸피리미딘(1.89분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시

5) 정량한계

하이드록시디메틸피리미딘(2-Hydroxy-4,6-dimethylpyrimidine): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.51 니트로푸라존(Nitrofurazone)

가. 시험법 적용범위

수산물 중 갑각류에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 니트로푸라존(Nitrofurazone)을 0.2% 메타인산 수용액:메탄올(6:4, v/v) 혼합용액으로 추출하고 HLB(Hydrophilic Lipophilic Balance) 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다. 니트로푸라존은 빛에 쉽게 분해되므로 실험과정에 사용되는 초자는 갈색유리병을 사용하거나 호일로 감싸 빛을 차단하여 실험한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 10 mM 암모늄아세테이트 수용액으로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 암모늄아세테이트(ammonium acetate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 암모늄아세테이트 0.78 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지 채운다.

6) 0.2% 메타인산 수용액:메탄올(6:4, v/v) 혼합용액: 1,000 mL 용량플라스크에 메타인산 2 g을 넣고 물에 녹여 표시선까지 채운 후 메탄올과 6:4의 비율로 혼합하여 추출용액으로 사용한다.

7) HLB 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

9) 용기: 갈색 유리기구

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 용기에 넣고 0.2% 메타인산:메탄올(6:4, v/v) 혼합용액 100 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한다. 이 용액을 whatman No.6 여과지가 깔린 뷰흐너깔때기로 감압 여과한다. 이 여과액{단, (껍질을 포함하는)민물 새우의 경우 여과액을 4℃에서 12,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 사용}을 40°C 이하에서 20〜30 mL가 되게 감압(또는 질소)농축한다. 미리 메탄올 5 mL, 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고 10% 메탄올 5 mL로 유출시켜 버린 뒤, 메탄올 5 mL로 용출하여 받는다. 용출액은 40℃ 이하에서 질소농축한 후, 잔류물은 10 mM 암모늄아세테이트:아세토니트릴(3:7, v/v) 혼합용액 1 mL로 녹이고 0.2 μm 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 50 mm, 1.7 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 암모늄아세테이트 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
0.5	95	5
1.5	70	30
2.0	70	30
3.0	95	5
5.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Capillary voltage: 2.8 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
니트로푸라존 (Nitrofurazone)	1.87	198.1	198.0	197.1	124.11)	10
					149.9	10
					79.9	10

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

니트로푸라존(1.87분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시

5) 정량한계

니트로푸라존(Nitrofurazone): 0.005 mg/kg(껍질을 포함하는 민물새우)

니트로푸라존(Nitrofurazone): 0.001 mg/kg(민물새우를 제외한 갑각류(가식부))

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.52 더콴텔(Derquantel)

가. 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 2 g(새우, 장어의 경우 1.5 g)과 80% 아세토니트릴 10 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 2,200 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞은 후 2,200 ×g에서 5분간 원심분리한다. 하층액 2 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축한 후 잔류물에 0.1% 포름산 수용액:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 0.4 mL를 넣어 녹인 뒤 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 50 mm, 1.3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
10.0	10	90
15.0	10	90
15.1	90	10
18.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
더콴텔 (Derquantel)	6.1	479.6	479.3	480.3	462.21)	25
					405.3	32
					148.1	44

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

더콴텔(6.1분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시

5) 정량한계

더콴텔(Derquantel): 0.0002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.53 요오드퀴놀린설폰산(Iodo hydroxy quinoline sulfonic acid)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 아세트산(acetic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 아세트산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량 플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴 8 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣어 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.3 mL가 될 때까지 질소 농축한 후 농축액에 0.1% 아세트산 수용액:0.1% 아세트산 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 2.2 mL를 넣어 녹인다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 아세트산 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 아세트산 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
3	95	5
5	5	95
12	5	95
15	95	5
20	95	5

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석 대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
요오드퀴놀린설폰산 (Iodo hydroxy quinoline sulfonic acid)	9.28	351.1	350.9	349.7	223.01)	38
					159.1	40
					80.0	90

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

요오드퀴놀린설폰산(9.28분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

요오드퀴놀린설폰산(Iodo hydroxy quinoline sulfonic acid): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.54 콜리스틴(Colistin)

가. 시험법 적용범위

축‧수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 콜리스틴을 1 N 염산(수산물의 경우, 0.5% 포름산 함유 5% 메탄올)으로 추출하고 HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance) 카트리지로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품(A와 B의 혼합물)을 50% 메탄올 용액에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 1% 포름산 함유 메탄올으로 희석하여 사용한다.

5) 0.5% 포름산 함유 5% 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 5 mL를 넣고 5% 메탄올 용액을 표시선까지 채운다.

6) 0.5%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 31.75mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 5mL를 넣고 포름산암모늄 2g을 넣어 물로 표시선까지 채운다.

7) HLB 카트리지(6 mL, 200 mg) 또는 이와 동등한 것

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

8) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 축산물

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 ㉠ 1 N 염산용액 5 mL를 넣어 추출한 후 4℃, 12,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. ㉠의 과정을 2회 반복하여 상층액을 합하고 이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 유출시켜 버린 후, 1% 포름산 함유 메탄올 4 mL로 용출하여 받는다. 이 용액을 흔들어 섞어 추출한 후 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

2) 수산물

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 ㉡ 0.5% 포름산 함유 5% 메탄올 5 mL를 넣어 흔들어 섞은 후 4℃, 12,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. ㉡의 과정을 2회 반복하여 상층액을 합하고 이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 5 mL와 물 5 mL로 활성화시킨 HLB 카트리지에 추출액을 흡착시키고 물 5 mL로 유출시켜 버린 후, 1% 포름산 함유 메탄올 4 mL로 용출하여 받는다. 이 용액을 흔들어 섞어 추출한 후 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 컬럼 온도: 40℃

다) 이동상

(1) 이동상 A: 0.5%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 31.75mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액

(2) 이동상 B: 1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	100	0
1.0	100	0
8.0	10	90
9.0	10	90
9.5	100	0
12.0	100	0

라) 이동상 유량: 0.3 mL/분

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 500℃

다) Capillary voltage: 3.5 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	콜리스틴 A (Colistin A)	4.65	1169.5	1168.8	585.3	101.01)	30
						202.0	20
						569.6	16
2	콜리스틴 B (Colistin B)	4.47	1155.4	1154.7	578.4	101.01)	30
						227.1	13
						576.5	16

마) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

콜리스틴 A(4.65분)

콜리스틴 B(4.47분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

콜리스틴(Colistin): 0.01 mg/kg(유(乳))

콜리스틴(Colistin): 0.05 mg/kg(유(乳)를 제외한 축·수산물)

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.55 나프타존(Naftazone), 디클로르보스(Dichlorvos), 클라노부틴(Clanobutin)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴으로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량 플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 함유 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 포름산암모늄 0.63g을 넣어 물로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고, 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 8 mL를 넣는다. 이를 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.5 mL가 될 때까지 질소 농축한 후, 농축액에 0.1% 포름산 함유 10 mM 포름산암모늄 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 2 mL를 넣어 녹인다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리 한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1% (v/v) 포름산(formic acid) 함유한 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
2	95	5
3	5	95
10	5	95
11	95	5
15	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	나프타존 (Naftazone)	8.04	Positive	215.2	215.1	216.1	199.21)	13
							143.2	27
							173.3	13
2	디클로르보스 (Dichlorvos)	8.13	Positive	220.9	220.0	221.0	109.01)	21
							127.2	35
							79.0	13
3	클라노부틴 (Clanobutin)	8.47	Negative	347.8	347.1	346.0	260.11)	16
							245.1	38
							134.0	54

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

나프타존(8.04분)

디클로르보스(8.13분)

클라노부틴(8.47분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

나프타존(Naftazone): 0.0004 mg/kg

디클로르보스(Dichlorvos): 0.001 mg/kg

클라노부틴(Clanobutin): 0.0001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.56 틸바로신(Tylvalosin)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴으로 추출하여 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 10 mM 포름산암모늄 용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄(ammonium formate) 0.63 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 넣는다. 이를 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 용액 7.5 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한다. 농축액에 10 mM 포름산암모늄 수용액:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 1.7 mL를 넣고 흔들어 섞는다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 10 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	90	10
3	90	10
5	10	90
13	10	90
15	90	10
20	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	틸바로신 (Tylvalosin)	10.49	1042.3	1041.6	1042.5	109.21)	75
						174.1	59
						229.1	47
2	3-AT (3-O-Acetyltylosin)	10.07	958.1	957.5	958.6	772.01)	45
						772.5	41

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

틸바로신(10.49분)

3-AT(10.07분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

틸바로신(Tylvalosin): 0.002 mg/kg

3-AT(3-O-Acetyltylosin): 0.0005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.57 메틸벤조쿠에이트(Methylbenzoquate)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 C18 분말로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 디메틸포름아미드(dimethylformamide, DMF)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.1% 포름산 함유 메탄올 용액으로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳)를 제외한 축산물

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g과 아세토니트릴 15 mL를 넣는다. 이를 15분간 흔들어 섞은 후 2,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 여기에 C18 분말 500 mg을 넣고 30초간 흔들어 섞은 후 2,000 ×g에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 6 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 0.1% 포름산 함유 메탄올 0.4 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

2) 유(乳)

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g, 아세트산나트륨 1 g, 아세토니트릴 15 mL를 넣는다. 이를 15분간 흔들어 섞은 후 2,000 ×g에서 10분간 원심분리하여 상층액을 취한다. 여기에 C18 분말 500 mg을 넣고 30초간 흔들어 섞은 후 2,000 ×g에서 5분간 원심분리하고 상층액 중 6 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 0.1% 포름산 함유 메탄올 0.4 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	55	45
12.0	5	95
17.0	5	95
17.1	55	45
20.0	55	45

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 45℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
메틸벤조쿠에이트 (Methylbenzoquate)	7.8	365.4	365.2	366.0	228.01)	41
					159.0	47
					215.0	34

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

메틸벤조쿠에이트(7.8분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

메틸벤조쿠에이트(Metylbenzoquate): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.58 포스멧(Phosmet)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출하고, 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 0.1% 포름산 함유 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.1% 포름산 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 80% 아세토니트릴 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세토니트릴 800 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 유(乳), 알(卵)을 제외한 축산물

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g, 염화나트륨 1 g, 80% 아세토니트릴 15 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후 2,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취한 후 헥산 15 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞고 2,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 하층액 1.5 mL를 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축한다. 여기에 0.1% 포름산 수용액:메탄올(1:1, v:v) 혼합용액 0.5 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

2) 유(乳), 알(卵)

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g(유(乳)는 6 g), 염화나트륨 1 g, 황산나트륨 1 g과 80% 아세토니트릴 15 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 2,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취한 후 헥산 15 mL를 넣고 30초간 흔들어 섞고 2,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 하층액 1.5 mL 취하여 50℃ 이하에서 질소 농축한다. 여기에 0.1% 포름산 수용액:메탄올(1:1, v:v) 혼합용액 0.5 mL를 넣어 녹인 후 0.2 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	55	45
7.0	5	95
12.0	5	95
12.1	55	45
15.0	55	45

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 45℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
포스멧 (Phosmet)	4.8	317.3	317.0	318.0	160.01)	12
					77.1	53
					133.0	36

1)정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

포스멧(4.8분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

포스멧(Phosmet): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.59 노시헵타이드(Noshiheptide)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고, C18 분말로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 0.1% 포름산 함유 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 0.1% 포름산 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g과 아세토니트릴 15 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 2,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취한 후 C18 분말 500 mg을 넣고 30초간 흔들어 섞는다. 2,000 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액 6 mL를 새로운 원심분리관에 취하여 50℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 0.1% 포름산 함유 메탄올 0.4 mL를 넣은 뒤 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	55	45
12.0	25	75
12.1	5	95
17.0	5	95
17.1	55	45
20.0	55	45

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 45℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간(분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
노시헵타이드 (Nosiheptide)	10.1	1222.4	1221.2	1222.2	238.91)	55
					169.8	49
					188.2	44

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

노시헵타이드(10.1분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

노시헵타이드(Noshiheptide): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.60 브로모프로필레이트(Bromopropylate)

가. 시험법 적용범위

축산물 등(벌꿀 포함)에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 C18 분말로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 5 mM 포름산 암모늄 함유 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 5 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

6) 5 mM 포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 꿀을 제외한 축산물

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 4 g과 아세토니트릴 15 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 2,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하고 C18 분말 500 mg을 넣고 30초간 흔들어 섞는다. 2,000 ×g에서 5분간 원심분리 후 상층액 6 mL를 새로운 원심분리관에 취한 후 50℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올 0.4 mL를 넣은 뒤 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

2) 꿀

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물 2 g을 넣은 후 1분간 흔들어 섞는다. 여기에 염화나트륨 2 g과 아세토니트릴 8 mL를 넣고 15분간 흔들어 섞은 후, 2,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 취하여 C18 분말 500 mg을 넣고 30초간 흔들어 섞은 뒤 2,000 ×g에서 5분간 원심분리한다. 새로운 원심분리관에 상층액을 모두 취하여 50℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올 0.4 mL를 넣은 뒤 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 5 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 5 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	35	65
4.0	5	95
9.0	5	95
9.1	45	65
11.5	45	65

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 45℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
브로모프로필레이트 (Bromopropylate)	3.7	428.1	425.9	446.0	324.81)	23
					209.0	39

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품의 크로마토그램

브로모프로필레이트(3.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

브로모프로필레이트(Bromopropylate): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.61 이소유게놀(Isoeugenol)

가. 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고, d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)을 이용하여 정제한 후 기체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

기체크로마토그래프-질량분석기(GC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) d-SPE: 무수황산마그네슘(MgSO4, Anhydrous magnesium sulfate), PSA(Primary Secondary Amine), C18(Octadecyl bonded silica)

6) 기타 시약: 특급 또는 이와 동등한 것

7) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 10분간 초음파 추출한 뒤 4℃, 4,000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 무수황산마그네슘 150 mg, PSA 25 mg과 C18 25 mg이 미리 담겨져 있는 2 mL 원심분리관에 상층액 1 mL를 넣는다. 5분간 강하게 흔들어 섞은 다음 4℃, 9,800 ×g에서 10분간 원심분리한 후, 상층액을 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 기체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: DB-5MS(30 m × 0.25 mm, 0.25 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상가스 및 이동상 유량: 헬륨(He) 또는 이와 동등한 것, 1.8 mL/분

다) 오븐 온도: 70℃에서 시험용액을 주입하여 2.5분간 유지한 후, 15℃/분의 비율로 175℃까지 온도를 상승시키고 5분간 유지하고, 50℃/분의 비율로 300℃까지 상승시킨 후 5분간 유지한다.

라) 주입부 온도: 270℃

마) 주입부: Split mode(10:1)

바) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화: 전자충격(EI), 70 eV

나) 인터페이스 온도: 280℃

다) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
이소유게놀 (Isoeugenol)	9.4	164.2	164.1	164.0	149.01)	10
					121.0	15
					77.0	30

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 기체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

이소유게놀(9.4분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

이소유게놀(Isoeugenol): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

기체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.62 아미트라즈(Amitraz)

가. 시험법 적용범위

축산물(벌꿀 제외) 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴로 추출하고 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 아세토니트릴로 희석하여 사용한다.

5) d-SPE: 무수황산마그네슘(MgSO4, Anhydrous magnesium sulfate), PSA(Primary secondary amine), C18(Octadecyl bonded silica)

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

7) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 아세토니트릴을 20 mL 넣고 1분간 흔들어 섞어 추출한다(지방은 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 5 N 수산화나트륨 0.2 mL과 아세토니트릴 20 mL를 첨가하여 1분간 강하게 흔들어 추출한다.). 여기에 무수황산마그네슘 4 g과 염화나트륨 1 g을 추가하여 1분간 흔들고 4,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액 중 6 mL를 무수황산마그네슘 900 mg, PSA 300 mg, C18 300 mg이 담긴 15 mL 원심분리관에 넣고 1분간 충분히 섞은 다음 이를 4,000 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 정제된 상층액 4 mL를 눈금이 있는 별도의 시험관에 옮겨 40℃에서 1 mL가 되도록 질소 농축한 후 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인 필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 물

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 아세트산(acetic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	85	15
0.5	85	15
3.0	70	30
6.0	10	90
10.0	10	90
11.0	85	15
15.0	85	15

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) Ionization mode: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	아미트라즈 (Amitraz)	7.76	293.4	293.4	294.1	163.01)	19
						106.9	57
2	2,4-디메틸아닐린 (2,4-Dimethylaniline)	2.80	121.2	121.1	122.0	103.01)	27
						78.9	35

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아미트라즈(7.76분)	2,4-디메틸아닐린(2.80분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

아미트라즈(Amitraz): 0.001 mg/kg(가금류고기, 유, 알)

0.005 mg/kg(가금류고기, 유, 알을 제외한 축산물)

2,4-디메틸아닐린(2,4-Dimethylaniline): 0.005 mg/kg(가금류고기, 유, 알)

0.01 mg/kg(가금류고기, 유, 알을 제외한 축산물)

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.63 사이로마진(Cyromazine)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 포름산 함유 아세토니트릴 용액, 황산마그네슘, 염화나트륨, 시트르산나트륨, 시트르산수소나트륨으로 추출하고, PSA(Primary Secondary Amine), C18, 황산마그네슘으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 아세트산(acetic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1% 아세트산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 8 mL를 넣은 후 10분간 흔들어 섞는다. 염화나트륨 1 g, 황산마그네슘 4 g, 시트르산나트륨 1 g, 시트르산수소나트륨 0.5 g을 넣고 흔들어 섞은 후, 4℃에서 2,600 ×g에서 15분간 원심분리하고 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 다음 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 PSA 150 mg, C18, 150 mg과 황산마그네슘 900 mg을 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한다. 농축액에 0.1% 아세트산 수용액:0.1% 아세트산 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 2.7 mL를 넣고 흔들어 섞는다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: HILIC계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 아세트산(acetic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 아세트산(acetic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	60	40
10	60	40

다) 이동상 유량: 0.20 mL/분

라) 컬럼 온도: 35℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

라) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
사이로마진 (Cyromazine)	1.3	166.1	166.1	167.1	85.11)	23
					68.0	41
					125.2	23

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

사이로마진(1.3분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

사이로마진(Cyromazine): 0.001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.64 디클로페낙(Diclofenac), 메토서페이트(Metoserpate), 부퀴놀레이트(Buquinolate)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 포름산암모늄 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 아세트산(acetic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산(formic acid) 함유 아세토니트릴: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 아세토니트릴로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 포름산 함유 아세토니트릴을 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 상층액을 50 mL 원심분리관에 취하여 헥산 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 15 mL 원심분리관에 담아 40℃ 이하에서 0.3 mL가 될 때까지 질소농축한 후 0.1% 아세트산 용액:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1.7 mL를 넣고 녹인다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 100 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 아세트산(acetic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	90	10
3	90	10
5	10	90
13	10	90
15	90	10
20	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature : 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precusor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	디클로페낙 (Diclofenac)	12.58	Negative	296.1	295.0	293.7	250.01)	12
							214.0	28
							178.0	38
2	메토서페이트 (Metoserpate)	9.03	Positive	428.5	428.2	429.1	174.11)	41
							131.1	89
							130.0	119
3	부퀴놀레이트 (Buquinolate)	12.19	Positive	361.4	361.2	362.1	204.01)	49
							316.2	23
							148.1	65

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

디클로페낙(12.58분)

메토서페이트(9.03분)

부퀴놀레이트(12.19분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

디클로페낙(Diclofenac): 0.002 mg/kg

메토서페이트(Metoserpate): 0.001 mg/kg

부퀴놀레이트(Buquinolate): 0.001 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.65 가미스로마이신(Gamithromycin), 설파니트란(Sulfanitran)

가. 시험법 적용범위

축산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세토니트릴, 염화나트륨으로 추출하고 PSA(Primary Secondary Amine), C18, 황산마그네슘(MgSO4)로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 50% 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 포름산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 15 mL 원심분리관에 취하고, 아세토니트릴 5 mL와 염화나트륨 1 g을 넣는다. 이를 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 PSA 25 mg, C18 25 mg, MgSO4 150 mg가 담겨진 15 mL 원심분리관에 취하여 1분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,700 ×g로 10분간 원심분리한다. 상층액을 취하여 40°C 이하에서 질소 농축한 후 잔류물에 0.1% 포름산 함유 메탄올 0.5 mL와 0.1% 포름산 수용액 0.5 mL를 넣어 녹인다. 이를 5분간 초음파 처리한 후 4℃에서 13,500 ×g로 3분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm × 150 mm, 5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	90	10
5	20	80
9	20	80
10	90	10
15	90	10

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	가미스로마이신 (Gamithromycin)	7.15	Positive	777.0	776.5	389.3	83.21)	37
							72.0	71
							55.1	75
2	설파니트란 (Sulfanitran)	9.25	Negative	335.3	335.1	334.0	136.41)	44
							133.1	36
							226.9	42

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

가미스로마이신(7.15분)

설파니트란(9.25분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

가미스로마이신(Gamithromycin): 0.005 mg/kg

설파니트란(Sulfanitran): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기 상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.66 이소플루프레돈아세테이트(Isoflupredone acetate)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴로 추출하고 헥산으로 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 아세트산(acetic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.1% 아세트산 함유 메탄올: 1,000 mL 용량 플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 5 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴 8 mL를 넣는다. 이를 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리하여 상층액 ⓐ를 취한다. 잔류물에 다시 0.1% 아세트산 함유 아세토니트릴 7 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃에서 2,600 ×g로서 15분간 원심분리하여 상층액 ⓑ를 취한다. 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액 ⓐ와 ⓑ를 합한 후 헥산 15 mL 넣고 10분간 흔들어 섞고 4℃에서 2,600 ×g로 15분간 원심분리한다. 하층액을 취하여 40℃ 이하에서 0.3 mL가 될 때까지 질소 농축한 후 농축액에 0.1% 아세트산 수용액:0.1% 아세트산 함유 메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 2.2 mL를 넣고 녹인다. 4℃에서 15,000 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 0.45 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과시킨 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 아세트산 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 아세트산 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0	95	5
3	95	5
5	5	95
13	5	95
15	95	5
20	95	5

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
이소플루프레돈 아세테이트 (Isoflupredone acetate)	10.51	420.5	420.2	421.2	237.31)	25
					341.3	17
					147.1	31

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

이소플루프레돈아세테이트(10.51분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

이소플루프레돈아세테이트(Isoflupredone acetate): 0.002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기 상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.67 독시싸이클린(Doxycycline), 린코마이신(Lincomycin), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 에리스로마이신(Erythromycin), 엔로플록사신(Enrofloxacin), 옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline), 클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline), 타일로신(Tylosin), 테트라싸이클린(Tetracycline), 트리메토프림(Trimethoprim)

가. 시험법 적용범위

벌꿀, 로얄젤리 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 분석대상물질을 EDTA-Na2 수용액과 구연산 수용액으로 추출하고 HLB 카트리지를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품(타일로신의 경우 타일로신 A 표준품을 사용한다)을 메탄올(엔로플록사신, 시프로플록사신은 0.2% 포름산 함유 메탄올)에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 0.5 M EDTA-Na2(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) 수용액: 500 mL 용량플라스크에 EDTA-Na2 dihydrate 93.1 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) 0.1 M 구연산(citric acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 구연산 19.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 추출용액: 0.5 M EDTA-Na2 수용액과 0.1 M 구연산 수용액을 2:8(v/v) 비율로 혼합한다.

9) 0.04% 암모니아수 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 암모니아 수용액(28%) 0.4 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

10) HLB 카트리지(Hydrophilic-Lipophilic Balance cartridge): Divinylbenzene-N-vinylpyrrolidone copolymer(500 mg) 고정상이 충전되어있는 일회용 카트리지(용량 6 mL) 또는 이와 동등한 것

11) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 아카시아꿀, 잡화꿀, 밤꿀

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 0.45 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하고 이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 2회 유출시켜 버린다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수 함유 메탄올 3 mL로 용출하여 받은 후, 45℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 녹여 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

2) 마누카꿀, 로얄젤리

균질화한 시료 1 g을 50 mL 원심분리관에 취한다. 추출용액 7 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 상층액을 새로운 원심분리관에 담고 추출용액 8 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞은 후 4℃, 2,600 ×g에서 15분간 원심분리한다. 0.45 μm PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인필터로 여과하고 이를 추출액으로 한다. 미리 메탄올 2 mL와 아세토니트릴 2 mL, 물 2 mL로 HLB 카트리지를 활성화시킨 후 추출액을 흡착시키고 물 4 mL로 3회 유출시켜 버린다. 새로운 원심분리관에 메탄올 3 mL, 아세토니트릴 3 mL, 0.04% 암모니아수 함유 메탄올 3 mL로 용출하여 받은 후, 45℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물은 메탄올 1 mL로 녹여 5분간 흔들어 섞은 후 4℃, 15,000 ×g에서 10분간 원심분리하고 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과한 것을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0	30	70
10	30	70

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 30℃

마) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 350℃

다) Collision gas: 질소(N2) 또는 이와 동등한 것

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온(Precursor ion, m/z)	생성이온(Product ion, m/z)	충돌에너지(Collision energy, eV)
1	독시싸이클린 (Doxycycline)	1.31	444.4	444.2	445.3	4281)	21
						98	61
						267	51
2	린코마이신 (Lincomycin)	1.26	406.5	406.2	407.3	1261)	37
						359	21
						125	73
3	시프로플록사신 (Ciprofloxacin)	1.28	331.3	331.1	332.2	3141)	23
						231	47
						288	19
4	에리스로마이신 (Erythromycin)	1.29	733.9	733.5	734.5	1581)	43
						83	73
						116	61
5	엔로플록사신 (Enrofloxacin)	1.29	359.4	359.2	360.2	3161)	23
						245	37
						342	25
6	옥시테트라싸이클린 (Oxytetracycline)	1.33	460.4	460.4	461.2	4261)	23
						201	51
						127	97
7	클로르테트라싸이클린 (Chlortetracycline)	1.34	478.9	478.1	479.3	4441)	23
						154	35
						462	21
8	타일로신 A (Tylosin A)	1.29	916.1	915.5	916.5	1741)	47
						101	65
						116	75
9	테트라싸이클린 (Tetracycline)	1.33	444.4	444.2	445.3	4101)	23
						154	33
						98	53
10	트리메토프림 (Trimethoprim)	1.28	290.3	290.1	291.2	1231)	31
						230	23
						261	35

라) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

독시싸이클린(1.31분)	린코마이신(1.26분)
시프로플록사신(1.28분)	에리스로마이신(1.29분)
엔로플록사신(1.33분)	옥시테트라싸이클린(1.34분)
클로르테트라싸이클린(1.34분)	타일로신 A(1.29분)
테트라싸이클린(1.34분)	트리메토프림(1.28분)

그림 1.표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

독시싸이클린(Doxycycline): 0.005 mg/kg

린코마이신(Lincomycin): 0.001 mg/kg

시프로플록사신(Ciprofloxacin): 0.005 mg/kg

에리스로마이신(Erythromycin): 0.002 mg/kg

엔로플록사신(Enrofloxacin): 0.005 mg/kg

옥시테트라싸이클린(Oxytetracycline): 0.01 mg/kg

클로르테트라싸이클린(Chlortetracycline): 0.005 mg/kg

타일로신 A(Tylosin A): 0.003 mg/kg

테트라싸이클린(tetracycline): 0.005 mg/kg

트리메토프림(trimethoprim): 0.003 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.68 플루랄라너(Fluralaner)

가. 시험법 적용범위

가금류고기 및 알(卵)에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 대상성분을 1% 아세트산 포함 아세토니트릴로 추출하고, 원심분리하여 상층액을 취해 PSA(Primary Secondary Amine), C18 및 GCB(Graphitized Carbon Black)를 이용하여 정제한 후 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 무처리 시료 추출물로 희석하여 사용한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 추출

시료를 균질화한 후 5 g을 정확히 달아 50 mL 원심분리관에 넣고 1% 아세트산 함유 아세토니트릴 15 mL를 넣고 1분간 강하게 흔들어 섞는다. 원심분리관에 무수황산마그네슘 6 g과 무수아세트산나트륨 1.5 g을 차례로 넣고 10분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃, 4,000 ×g에서 10분간 원심분리한다.

2) 정제

새로운 15 mL 원심분리관에 무수황산마그네슘 1,200 mg, C18 400 mg, PSA 400 mg과 GCB 45 mg을 넣고 ‘1) 추출’로부터 얻은 용액 중 상층액 6 mL를 넣고 1분간 강하게 흔들어 섞은 후 4℃, 4000 ×g에서 10분간 원심분리한다. 상층액 중 3 mL를 취하여 질소 농축하고 잔류물에 메탄올 1 mL를 넣어 녹인다. 추출액을 0.2 μm nylon 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.0 mm ⨯ 50 mm, 3 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 5 mM 아세트산암모늄 함유한 0.1%(v/v) 포름산 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
3.0	10	90
7.0	10	90
7.1	95	5
12.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 320℃

다) Capillary voltage: 3.7 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
플루랄라너 (Fluralaner)	7.14	556.3	555.1	556	4001)	24
					160	38
					132	46

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

닭고기

알(卵)

플루랄라너(7.2분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

플루랄라너(Fluralaner): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 플루랄라너를 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8.3.69 루페뉴론(Lufenuron), 테플루벤주론(Teflubenzuron)

가. 시험법 적용범위

수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중의 루페뉴론과 테플루벤주론을 아세토니트릴로 추출하고 C18 흡착제로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다. 조제된 표준원액은 냉동 보관한다.

4) 혼합표준용액: 각각의 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 5 mM 포름산암모늄 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) 5 mM 포름산암모늄 함유 메탄올: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄 315.3 mg을 넣고 메탄올로 표시선까지 채운다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 물 2 mL와 아세토니트릴 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞는다. 황산마그네슘 4 g과 초산나트륨 1 g을 넣고 20분간 흔들어 섞은 후 2,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 취하여 C18 100 mg이 담긴 새로운 50 mL 원심분리관에 옮기고 10분간 흔들어 섞은 후 2,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 원심분리한 상층액을 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮기고 50℃ 이하에서 질소농축한다. 잔류물에 물:아세토니트릴(1:1, v/v) 혼합용액 2 mL를 넣어 녹이고 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm i.d. × 150 mm, 2.6 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 5 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	80	20
1.0	80	20
5.0	20	80
10.0	10	90
15.0	10	90
15.1	80	20
20.0	80	20

(2) 이동상 B: 5 mM 포름산암모늄(ammonium formate) 함유한 메탄올

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Capillary voltage: 4.5 kV

마) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

바) 분석대상물질 조건

연번	분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	루페뉴론 (Lufenuron)	8.5	511.1	510.0	511	1581)	23
						141	50
						113	53
2	테플루벤주론 (Teflubenzuron)	8.4	381.1	380.0	381	1581)	15
						141	37
						113	54

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

루페뉴론(8.5분)

테플루벤주론(8.4분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

루페뉴론(Lufenuron): 0.005 mg/kg

테플루벤주론(Teflubenzuron): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.70 루바베그론(Lubabegron) 시험법

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 아세트산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 추출하고 헥산 또는 PSA(Primary Secondary Amine)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

5) 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6): 1,000 mL 용량플라스크에 아세트산나트륨 0.82 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 아세트산으로 pH를 4.6으로 맞추고 사용한다.

6) 1% 아세트산(acetic acid) 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액: 100 mL 용량플라스크에 아세트산 1 mL를 넣고 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 표시선까지 채운다.

7) 0.1 mM 불화암모늄(ammonium fluoride) 수용액: 1,000mL 용량플라스크 불화암모늄 3.7 mg을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

8) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하여 10 mM 아세테이트 완충용액(pH 4.6) 2 mL를 넣고 2분간 초음파 처리하여 흔들어 섞어 추출한다. β-글루쿠로니다제/아릴설파타제(β-glucuronidase/ arylsufatase) 20 μL를 넣고 65℃에서 1시간 중탕한 후 상온에서 냉각한다. 이 용액에 1% 아세트산 함유 아세토니트릴:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액을 12 mL를 넣고 10분간 초음파 처리 후 15분간 흔들어 섞고 4℃에서 9,300 ×g로 10분간 원심분리한다. (㉠돼지고기를 제외한 축수산물의 경우, 새로운 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 헥산 12 mL를 넣고 2분간 흔들어 섞는다. 4℃에서 9,300 ×g로 5분간 원심분리한 후 하층액을 취하여 감압(또는 질소)농축한다. ㉡돼지고기의 경우, PSA 500 mg이 담겨진 50 mL 원심분리관에 상층액을 취하여 5분간 흔들어 섞는다.) 4℃에서 9,300 ×g로 5분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 감압(또는 질소)농축한다. 잔류물에 50% 메탄올 1 mL를 넣어 녹이고 상온에서 15,800 ×g로 10분간 원심분리한 후 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1 mM 불화암모늄(ammonium fluoride) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.00	50	50
4.00	0	100
7.00	0	100
7.01	50	50
10.00	50	50

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 3.6 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
루바베그론 (Lubabegron)	3.3	499.6	499.2	500	215	29
					2501)	20
					251	25

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

루바베그론(3.3분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

루바베그론(Lubabegron): 0.0002 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.71 쿠마포스(Coumaphos)

8.3.71.1 제1법

벌꿀에 적용하며, 8.3.20 시미아졸(Cymiazole), 아미트라즈(Amitraz), 쿠마포스(Coumaphos), 플루발리네이트(Fluvalinate)의 시험법에 따른다.

8.3.71.2 제2법

가. 시험법 적용범위

축산물(벌꿀 제외)에 적용한다.

나. 분석원리

시료를 아세토니트릴로 추출하여 황산마그네슘 및 염화나트륨을 이용하여 수분제거 및 분배하고 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 측정기기

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각각의 표준품을 아세토니트릴에 녹여 1,000 mg/L가 되게 한다.

4) 표준용액: 무처리 시료 추출물로 희석하여 사용한다(무처리 시료 추출물 90% 이상 포함).

5) d-SPE: 무수황산마그네슘(MgSO4, Anhydrous magnesium sulfate), PSA(Primary secondary amine), C18(Octadecyl bonded silica)

6) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 추출

균질화한 시료 5 g을 정밀히 달아 50 mL 용량의 원심분리관에 넣고 아세토니트릴 10 mL를 넣은 뒤 1분간 강하게 흔들어 섞고 무수황산마그네슘 4 g과 염화나트륨 1 g을 넣어 10분간 강하게 흔들어 섞은 다음 4℃, 4,000 ×g에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한다.

2) 정제

무수황산마그네슘 150 mg과 PSA 25 mg, C18 25 mg이 미리 담겨져 있는 2 mL 원심분리관에 ‘가) 추출’로부터 얻은 상층액 1 mL를 넣고 1분간 강하게 흔들어 섞은 다음 이를 원심분리 등의 방법으로 층을 분리한 후 상층액을 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm ⨯ 100 mm, 2.7 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid)과 5 mM 포름산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 수용액

(2) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid)과 5 mM 포름산암모늄(Ammonium formate)을 함유한 메탄올

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
1.0	95	5
3.0	40	60
13.0	0	100
18.0	0	100
18.1	95	5
23.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 4 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 150℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)		머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
1	쿠마포스 (Coumaphos)	9.30	362.8	362.0	363	2271)	28
						307	20
	쿠마포스 옥손 (Coumaphos oxon)	6.72	346.7	346.0	347	2911)	24
						211	33

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

쿠마포스(9.3분)	쿠마포스 옥손(6.7분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

쿠마포스(Coumaphos): 0.01 mg/kg

쿠마포스 옥손(Coumaphos oxon): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험
액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 해당 성분을 확인한다.

아. 정량시험
위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 검량선에 대입하여 정량한다.

8.3.72 아나코린(Anacolin), 에페드린(Ephedrine)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료를 아세토니트릴로 추출한 후 황산마그네슘, 염화나트륨을 이용하여 수분 제거 및 분배하고 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 각각의 표준품을 정밀히 달아 아나코린은 DMSO, 에페드린은 메탄올에 녹여 조제한 용액을 표준원액으로 한다.

4) 혼합표준용액: 각 표준원액을 메탄올로 희석하여 적당한 농도가 되게 한다.

5) 0.1% 포름산(formic acid) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 1 mL를 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) d-SPE: 무수황산마그네슘(MgSO4, anhydrous magnesium sulfate), PSA(Primary Secondary Amine)

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 정밀히 달아 50 mL 원심분리관에 취하고 황산마그네슘 400 mg과 염화나트륨 100 mg, 아세토니트릴 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다. 3,500 ×g, -4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액 모두 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. PSA 50 mg, 무수황산마그네슘 300 mg을 넣고 10분간 흔들어 섞은 후, 혼합용액을 3,500 ×g, -4℃에서 10분간 원심분리한다. 분리된 용액 중 5 mL를 취하여 40℃ 이하에서 질소농축한다. 0.1% 포름산 수용액 850 μL와 아세토니트릴 150 μL를 넣고 녹인 뒤 10분간 흔들어 섞는다. 혼합된 용액을 0.2 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 폴리프로필렌 바이알에 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	85	15
2.0	85	15
5.0	50	50
8.0	50	50
10.0	10	90
12.0	10	90
12.1	85	15
17.0	85	15

다) 이동상 유량: 0.2 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
아나코린 (Anacolin)	6.49	465.4	465.12	338.4	105.11)	40
					183.1	30
					98.1	50
에페드린 (Ephedrine)	1.95	165.2	165.12	166.0	148.11)	15
					115.1	27
					91.1	34

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

아나코린(Anacolin)(6.49분)	에페드린(Ephedrine)(1.95분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

아나코린(Anacolin): 0.005 mg/kg

에페드린(Ephedrine): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.73 메니클로포란(Menichlopholan), 피페로닐 부톡사이드(Piperonyl butoxide)

가. 시험법 적용범위

축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리

시료 중 분석대상물질을 포름산암모늄과 EDTA 혼합 수용액, 1% 아세트산을 함유하는 아세토니트릴:디클로로메탄 혼합용액(90:10, v/v)을 사용하여 추출하고 d-SPE(dispersive-Solid Phase Extraction)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: Menichlopholan, Piperonyl butoxide를 아세토니트릴에 녹여 1 mg/mL가 되도록 한다.

4) 혼합표준용액: 각 표준원액을 아세토니트릴로 희석하여 적당한 농도가 되게한다.

5) 100 mM 포름산암모늄과 EDTA 혼합 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄(ammonium formate) 6.3 g과 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) 37.2 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

6) d-SPE: 무수황산마그네슘(MgSO4, anhydrous magnesium sulfate), PSA(Primary Secondary Amine), C18(Octadecyl bonded silica)

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

1) 추출

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 100 mM 포름산암모늄과 EDTA 혼합 수용액 1 mL, 염화나트륨 1 g, 1% 아세트산을 함유하는 아세토니트릴-디클로로메탄 혼합용액(90:10, v/v) 5 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞어 추출한다. 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한 후 상층액 모두를 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다.

2) 정제

무수황산마그네슘 75 mg, PSA 12.5 mg, C18 12.5 mg를 넣고 1분간 흔들어 섞은 후, 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액을 15 mL 원심분리관에 옮기고 40℃에서 질소 농축한 후, 아세토니트릴 0.4 mL를 넣고 1분간 흔들어 섞고, 3분간 초음파 추출한다. 이를 13,500 ×g, 4℃에서 3분간 또는 이와 동등한 조건에서 원심분리한 상층액을 시험용액으로 한다.

바. 시험조작

1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1 %(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1 %(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	98	2
1.2	98	2
3.0	60	40
7.0	30	70
10.0	0	100
13.2	0	100
13.3	98	2
17.0	98	2

다) 이동상 유량: 0.25 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 2 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode, Negative ion mode)

나) Capillary temperature: 250℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 또는 이와 동등한 것

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
메니클로포란 (Menichlopholan)	10.40	Negative	345.0	344.0	343.0	296.91)	20
						341.0	27
						249.8	36
피페로닐 부톡사이드 (Piperonyl butoxide)	10.27	Positive	338.4	338.2	356.3	119.01)	33
						149.0	31

마) 분석대상물질 조건

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

메니클로포란(10.40분)	피페로닐 부톡사이드(10.27분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

메니클로포란(Menichlopholan): 0.005 mg/kg

피페로닐 부톡사이드(Piperonyl butoxide): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.74 스트리키닌(Strychnine)

가. 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 30% ammonium hydroxide를 2% 첨가한 ethyl acetate로 추출하고 PSA(Primary Secondary Amine)로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 메탄올로 희석하여 사용한다.

6) 20 mM 포름산 암모늄(pH 4.0): 1,000 mL 용량플라스크에 포름산암모늄(ammonium formate)을 1.26 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다. 포름산으로 pH를 4.0으로 맞추고 사용한다.

7) 기타시약: 특급 또는 이와 동등한 것

8) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 제질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 1 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 30% ammonium hydroxide를 2% 첨가한 ethyl acetate 6 mL를 첨가한 후 30분간 흔들어 섞는다. 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액 모두를 취하고, 다시 추출용매를 첨가하여 동일한 과정을 반복한다. 상층액을 PSA 50 mg이 들어있는 새로운 시험관에 옮긴 뒤 1분간 흔들어 섞은 후 4,700 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 상층액 모두를(유(乳)의 경우, 상층액 중 6 mL를) 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃에서 질소농축한다. 잔류물에 acetonitrile:methanol(6:4, v/v):20 mM ammonium formate(pH 4.0)(1:1, v/v) 1 mL를 넣고 녹인 후, 0.20 μm PTFE(polytetrafluoroethylene) 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C18계 컬럼(2.1 mm × 150 mm, 3.5 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	95	5
0.5	95	5
5.5	40	60
6.0	0	100
10.0	0	100
10.2	95	5
12.0	95	5

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 5 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 및 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	이온화 (Ionization mode)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
스트리키닌 (Strychnine)	3.99	Positive	334.4	334.2	335.0	184.11)	37
						156.1	45
						129.1	55

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

스트리키닌(3.99분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

스트리키닌(Strychnine): 0.005 mg/kg

사. 정성 및 확인시험
액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.

8.3.75 메티마졸(Methimazole)

가. 시험법 적용범위
축·수산물 등에 적용한다.

나. 분석원리
시료 중 분석대상물질을 80% 아세토니트릴로 추출 후 C18으로 정제하여 액체크로마토그래프-질량분석기로 분석한다.

다. 장치

액체크로마토그래프-질량분석기(LC-MS/MS)

라. 시약 및 시액

1) 용매: 액체크로마토그래프용 또는 이와 동등한 것

2) 물: 3차 정제수 또는 이와 동등한 것

3) 표준원액: 표준품을 메탄올에 녹여 1,000 mg/L가 되도록 한다.

4) 표준용액: 표준원액을 잔류허용기준 또는 검출에 적합한 농도가 되도록 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액으로 희석하여 사용한다.

5) 0.1 M Na2-EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate): 500 mL 용량플라스크에 Na2-EDTA 18.62 g를 물을 넣고 용해 후 sodium hydroxide를 이용하여 pH 11로 한 후 물로 표시선까지 채운다.

6) 5 mM 포름산 암모늄(Ammonium formate) 수용액: 1,000 mL 용량플라스크에 포름산 암모늄 0.314 g을 넣고 물로 표시선까지 채운다.

7) C18 분말: 잔여 실란올기가 제거된 C18 분말(55∼105 μm, 125 Å) 또는 이와 동등한 것

8) 기타 시약: 특급 또는 이와 동등한 것

9) 기구: 사용하는 모든 용기는 폴리프로필렌 재질 또는 이와 동등한 것

마. 시험용액 조제

균질화한 시료 2 g을 50 mL 원심분리관에 취하고 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 10 mL를 넣고 10분간 흔들어 섞는다(단, 알 및 수산물의 경우 0.1 M Na2-EDTA 1 mL를 넣고 물:아세토니트릴(1:4, v/v) 혼합용액 9 mL를 넣는다.). 4,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리 후 상층액 모두를 취하여 새로운 50 mL 원심분리관에 옮긴다. C18 분말 500 mg과 아세토니트릴 포화 헥산 10 mL를 넣고 5분간 흔들어 섞은 후 4,800 ×g, 4℃에서 10분간 원심분리한다. 분말을 제외한 하층액 중 5 mL를 취하여 새로운 원심분리관에 옮기고 40℃ 이하에서 질소 농축한다. 잔류물에 물:메탄올(1:1, v/v) 혼합용액 1 mL를 넣고 녹인 후, 4,800 ×g, 4℃에서 3분간 원심분리하고 얻은 상층액을 0.2 μm nylon 멤브레인필터로 여과하여 시험용액으로 한다.

바. 시험조작
1) 액체크로마토그래프 분석조건

가) 컬럼: C8계 컬럼(3 mm × 150 mm, 3.0 μm) 또는 이와 동등한 것

나) 이동상

(1) 이동상 A: 5 mM 포름산 암모늄(ammonium formate) 함유한 수용액

(2) 이동상 B: 0.1%(v/v) 포름산(formic acid) 함유한 아세토니트릴

시간(분)	A(%)	B(%)
0.0	90	10
1.0	90	10
5.5	40	60
6.0	0	100
10.0	0	100
10.2	90	10
12.0	90	10

다) 이동상 유량: 0.3 mL/분

라) 컬럼 온도: 40℃

마) 주입량: 10 μL

2) 질량분석기 분석조건

가) 이온화 방법: ESI(Positive ion mode)

나) Capillary temperature: 300℃

다) Capillary voltage: 4.0 kV

라) Collision gas: 아르곤(Ar) 및 이와 동등한 것

마) 분석대상물질 조건

분석성분 (Compound)	머무름 시간 (분)	분자량 (MW)	관측질량 (Exact mass)	선구이온 (Precursor ion, m/z)	생성이온 (Product ion, m/z)	충돌에너지 (Collision energy, eV)
메티마졸 (Methimazole)	4.5	114.2	114.03	115.05	81.051)	29
					88.30	17

1) 정량이온

3) 검량선 작성
표준용액을 농도별로 일정량 취하여 액체크로마토그래프-질량분석기에 각각 주입하여 얻은 크로마토그램상의 각 피크 높이 또는 면적 값으로 검량선을 작성한다.

4) 표준품 크로마토그램

메티마졸(4.5분)

그림 1. 표준품의 크로마토그램 예시.

5) 정량한계

메티마졸(Methimazole): 0.01 mg/kg

사. 정성 및 확인시험

액체크로마토그래프-질량분석기상의 표준용액과 시험용액의 머무름 시간과 특성이온으로 확인한다.

아. 정량시험

위 조건으로 얻어진 크로마토그램상의 피크가 표준용액 피크의 머무름 시간과 일치할 때 피크 높이 또는 면적을 시료검량곡선(sample calibration curve)에 대입하여 정량한다.